颈椎后纵韧带骨化症与BMP-2、BMP-4基因多态性的关联性研究

周 耀魏 威陈春悦叶 杨

1浙江省奉化市中医医院 奉化 315500 2浙江省中西医结合医院

颈椎后纵韧带骨化症与BMP-2、BMP-4基因多态性的关联性研究

周 耀1魏 威2陈春悦2叶 杨2

1浙江省奉化市中医医院 奉化 315500 2浙江省中西医结合医院

目的探讨颈椎后纵韧带骨化症（OPLL）与BMP-2基因第3外显子的rs79417223和BMP-4基因第4外显子的rs147822607两个SNP位点的相关性。方法选取47例浙江地区汉族颈椎后纵韧带骨化症患者，以100名正常个体作为对照组，采用PCR+Sanger DNA测序，统计分析2个位点基因型的分布信息。结果BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A患者、BMP-4第4外显子的rs147822607A→C患者与正常组呈现明显差异（P＜0.05，P＜0.01）。结论BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A、BMP-4基因、第4外显子的rs147822607A→C，这2个多态性位点与OPLL的发病具有强烈相关性。

颈椎后纵韧带骨化症；单核苷酸多态性；易感基因；BMP-2基因；BMP-4基因

颈椎后纵韧带骨化症（ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL）属于一种骨成形病，表现为颈椎后纵韧带内异位骨的形成，主要压迫脊髓产生临床症状以及病理损害。OPLL为一种遗传因素和环境因素共同作用所致的复杂疾病（多基因疾病）[1-6]，高发于日本人以及亚洲人。通过检索国内外相关文献，我们选取2个可疑的OPLL易感基因多态性SNP位点，BMP-2基因第 3外显子的 rs79417223和BMP-4基因第4外显子的rs147822607，进行多态性分析，以期获得这2个多态性位点与浙江地区汉族OPLL患者发病之间的关联性。

1 资料与方法

1.1临床资料 2010年7月—2013年9月就诊于浙江省奉化市中医院、浙江省中西医结合医院、解放军一一七医院等骨科的汉族OPLL患者47例，男30例，女17例，平均年龄（45.4±11.2）岁，病程0.3～8年，平均（4.1±1.2）年。根据颈部CT或者MRI明确诊断[7]。患者籍贯均在浙江地区。同时，以100名无血缘关系的浙江地区汉族正常个体作为对照组，男50名，女50名，平均年龄（43.1±7.3）岁。每位参与者均签署书面知情同意书。

1.2方 法 ①DNA制备：入组者均在无菌环境下抽取外周血10mL（EDTA抗凝）。用外周血DNA纯化试剂盒（德国Qiagen公司）提取和纯化基因组DNA。②PCR引物的合成：参考NCBI等人类基因组SNP数据库，用Primer Premier 5.0软件设计2个基因SNP位点的PCR引物序列。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表1。③DNA测序分型对各多态性SNP位点分别进行PCR扩增，通过Sanger DNA测序进行基因分型。PCR产物的DNA测序委托上海生工生物工程公司进行。根据基因分型结果，计算基因型频率和等位基因频率。

1.3统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，采用χ2检验，P＜0.05，表示具有统计学意义。

2 结 果

2个多态性SNP位点的基因型分布经χ2检验，符合Hardy-Weinberg遗传平衡[8]。BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A患者与正常组呈现明显差异（P＜0.05）。BMP-4第4外显子的rs147822607A→C患者与正常组呈现明显差异（P＜0.01）。各等位基因在患者组与正常对照组中的分布和分析结果，见表2。

表2 两组rs79417223和rs147822607分布及比较 例

3 讨论

OPLL是一种高发于日本人以及亚洲人的常见病。日本人的发病率约为1.9%～4.3%，韩国人约为3.6%，我国台湾省约为2.8%，我国北方人群的OPLL发病率约为0.44%～8.92%，而北美白人仅为0.12%[1-3]。OPLL是引起脊髓病的重要原因，大部分可保持长期稳定状态，起病隐匿，进展缓慢，呈现恶性发展趋势，可引起脊髓不可逆性损害，其中部分患者的脊髓功能出现急剧恶化[1]。OPLL的致瘫风险显著高于其他颈椎退行性疾病，其原因包括缺乏有效的早期筛选方法和诊断方法，自然史不明，无法确定手术时机，术后骨化物持续生长等。目前，临床上尚无有效的方法延缓和改善OPLL的骨化过程，手术疗法仍然是最主要的治疗手段，但风险系数较高[1]。1989年，Terayama等发现，日本OPLL家系中先证者亲属的发病率显著高于普通人群[4]。在北美OPLL患者中，尽管大部分病例为散发性，但仍可见部分病例具有家族聚集性[5]。目前已经达成共识，OPLL是一种严重危害人体健康的复杂性多基因遗传病，其发病机制不详，迄今没有可靠的生物学识别指标[1-2]。许多学者已做了大量的医学研究来揭示OPLL发病的分子医学基础[9]。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）为多功能蛋白，具有独特的骨形成作用和其他形态发生过程。BMP-2基因定位于20p12，而BMP-4基因位于14q22-q23。Kawaguchi等[10]曾发现某例OPLL患者术后标本中的BMP-2仅表达于骨质化的基质、软骨细胞以及邻近OPLL软骨的成纤维细胞中，而不在未骨质化的颈椎后纵韧带中表达。Kon等[11]对从OPLL和非OPLL患者的脊柱韧带中分离到的成纤维细胞进行体外培养后，也发现BMP-2优先诱导OPLL患者的成纤维细胞的成骨分化。Wang等[12]对192例汉族OPLL患者和304名健康对照的研究表明，具有BMP-2基因第3外显子SNP TC和CC基因型的男性更易罹患OPLL。Karasugi等[2]最新的一项对214例日本OPLL患病同胞对的大规模全基因组连锁分析研究显示，OPLL最有可能的易感基因区域位于20p12的微卫星标记D20S894附近（NPL= 3.43，P=0.000，27）。而Furushima等[13]对126例日本OPLL患病同胞对进行了的大规模候选基因筛查发现，仅BMP-4基因与OPLL显著关联（NPL=2.230，P=0.035）。本研究分别选取了BMP-2第3外显子的rs79417223和BMP-4第4外显子的rs147822607两个SNP位点进行分析，研究结果发现BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A患者与正常组呈现明显差异（P＜0.05）。BMP-4第4外显子的rs147822607A→C患者与正常组呈现明显差异（P＜0.01）。本研究提示BMP-2基因第3外显子的rs79417223G→A、BMP-4基因第4外显子的rs147822607A→C，这2个多态性位点与OPLL的发病具有强烈相关性。

由于取材等方面的原因，目前直接在人颈椎后纵韧带组织细胞水平上探讨OPLL的易感基因表达水平还比较困难，加之该病呈复杂性多基因遗传方式，并表现出强烈的遗传异质性和表型异质性，因而尚无法准确地确定致病基因，并阐释易感基因的基因-基因、基因-环境之间的相互作用及其在OPLL发病中的地位[1-3，9]。因此，对大样本患者群体进行可疑易感基因的SNP分型，寻找和鉴定相关的致病基因，是切实可行的研究方法之一。由于受时间、地点限制，本研究只收集到了47例浙江地区汉族OPLL患者，选择了2个基因多态性SNP位点进行了初步研究。研究结果提示此位点与OPLL的发病具有强烈相关性。但本研究的患者均来自于中国浙江地区，而且研究的样本数又相对偏小，所以研究结果与以前文献报道可能会存在有一些差异。在今后的研究中，可以将样本再扩大化，并且运用目前先进的外显子捕获二代测序技术运用于OPLL基因外显子组水平的分析研究，以获得OPLL发生的分子遗传学基础[9]。

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Relationship Between the Gene Polymorphisms of BMP-2 and BMP-4 with Ossification of Posterior Longitudinal Ligament of the Spine in a Chinese population

ZHOU Yao1,WEI Wei2,CHEN Chunyue2,YE Yang2. 1 Fenghua Chinese Medical Hospital of Zhejiang Province,Fenghua(315500),China;2 Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Province

ObjectiveTo explore the relationship between 2 single nucleotide polymorphisms（SNPs）of BMP-2 and BMP-4 and ossification of posterior longitudinal ligament of the spine（OPLL）in a Chinese population.MethodsForty-seven sporadic OPLL patients and 100 healthy controls in Zhejiang area were recruited for association analysis.The SNP regions of BMP-2 and BMP-4 genes were amplified by PCR and Sanger sequencing.Genotype frequencies of the SNPs were compared between the cases and control subjects with SPSS 13.0 software.ResultsBoth Of the rs79417223 G→A site in the exon 3 of BMP-2 and the rs147822607 A→C site in the exon 4 of BMP-4，the patient and normal control groups showed significant differences（P＜0.05，P＜0.01）.ConclusionsThe rs79417223 and rs147822607 have a strong correlation to OPLL.

ossification of posterior longitudinal ligament；single nucleotide polymorphism；susceptibility gene；BMP-2 gene；BMP-4 gene

2013-12-01

浙江省医药卫生科技计划项目（No.2010KY168），浙江省宁波市科技计划项目（No.2013C50023）

叶杨，E-mail：dagou1234@163.com