芍药甘草汤对哮喘大鼠STAT 6与IL-13水平的影响

董 雷蔡宛如朱诗乒

1浙江省新华医院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中医院呼吸科

·论 著·

芍药甘草汤对哮喘大鼠STAT 6与IL-13水平的影响

董 雷1蔡宛如1朱诗乒2

1浙江省新华医院呼吸科 杭州 310005 2杭州市中医院呼吸科

目的观察芍药甘草汤对哮喘大鼠信号传导和转录激活因子6（STAT 6）与白介素-13（IL-13）水平的干预作用，探讨其防治支气管哮喘的作用机制。方法60只SD雄性大鼠随机分为正常对照组（NULL组）、模型组（OVA组）、地塞米松组（DXM组）及芍药甘草汤高（SG10组）、中（SG5组）、低（SG2.5组）剂量组，每组10只。除正常对照组外均行支气管哮喘造模，相应药物灌胃。检测各组大鼠支气管肺泡灌洗液中白细胞和嗜酸性粒细胞计数，免疫组化法测肺组织中STAT 6蛋白表达，ELISA法检测血浆中IL-13含量。结果与NULL组比较，OVA组哮喘大鼠肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数、嗜酸性粒细胞计数及气道上皮STAT 6表达和血浆IL-13水平均明显升高（P＜0.01）。DXM组及各剂量芍药甘草汤组BALF中白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数、气道上皮STAT 6表达和血浆IL-13水平较OVA组降低（P＜0.01），但仍高于NULL组（P＜0.01）。结论芍药甘草汤防治大鼠支气管哮喘的作用机制可能与抑制哮喘大鼠肺组织STAT 6表达，降低血浆IL-13水平，降低哮喘大鼠BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数有关。

大鼠；哮喘；芍药甘草汤；信号传导和转录激活因子6；白介素-13

支气管哮喘是一种由多种因素引起的以可逆性气道阻塞、气道高反应性和气道炎症为特征的免疫变态反应性疾病。芍药甘草汤系张仲景《伤寒论》中的著名方剂，主要由芍药和甘草二味中药等量组成，药理研究证实，芍药甘草汤具有明显的解痉、镇痛、抗炎等作用[1]。近十几年来，单用此方或随症加减治疗哮喘、顽咳和小儿百日咳疗效十分显著[2]。本研究旨在探讨芍药甘草汤治疗哮喘的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 雄性清洁级SD大鼠60只，体质量（200±20）g，由浙江中医药大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：2011A032。

1.2试剂与药物 卵白蛋白（Sigma公司）；氢氧化铝干粉（广州化学试剂厂，批号961201-2）；地塞米松片（浙江仙居制药股份有限公司）；IL-13 ELISA试剂盒（ADL公司，批号070633）；免疫大鼠STAT6多克隆抗体（晶美公司）；芍药甘草汤（芍药、甘草等分组成，药材由浙江省中医院中药房提供，浓煎成每毫升含1g生药）；

1.3实验仪器 M304020压缩雾化机（德国百瑞公司），OLYMPUS BX50显微摄像系统（日本OLYMPUS公司）。

1.4动物分组及模型建立 60只SD大鼠随机分为正常对照组（NULL组）、模型组（OVA组）、地塞米松组（DXM组）、芍药甘草汤高剂量组（SG10组）、芍药甘草汤中剂量组（SG5组）、芍药甘草汤低剂量组（SG2.5组），每组10只。除正常对照组之外，其余各组均进行支气管哮喘造模[3]。造模方法：第1、7、14天分别给予鸡卵白蛋白（OVA）抗原液1mL（含OVA 10mg，氢氧化铝凝胶20mg，灭活百日咳杆菌5×109个）腹腔注射，1天1次，第21天开始给予1%OVA溶液雾化吸入，1天1次，每次30min，连续3天。以大鼠出现呼吸急促，点头呼吸，甚则四肢末端紫绀为造模成功的标志。正常对照组：第1、7、14天分别给予生理盐水1mL腹腔注射，第21天开始给予生理盐水超声雾化吸入，1天1次，每次30min，连续3天。

1.5给药方法 每次雾化前30min，NULL组、OVA组予生理盐水10mL/kg体质量灌胃；DXM组予DXM 1mg/kg灌胃；SG10组、SG5组、SG2.5组予芍药甘草汤10g/kg、5g/kg、2.5g/kg灌胃。

1.6标本采集和处理 各组均于首次雾化后5d采集和处理标本。每组大鼠均予3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取血制备血浆，右肺肺泡灌洗，左肺留取病理。

1.7检测指标及方法

1.7.1支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数测定 取血完毕后大鼠行气管插管至右肺并结扎，用4℃生理盐水行支气管肺泡灌洗，每次3mL，反复灌洗3次，回收率均大于50%，取0.1mLBALF在显微镜下用血细胞计数板计算白细胞总数，然后将BALF离心10min（1000rpm），离心沉淀后细胞团重悬于1mLPBS（磷酸盐缓冲溶液）中，取0.2mL图片，瑞吉染液染色，至少计数400个细胞做细胞分类，再计算嗜酸性粒细胞数目。

1.7.2血浆IL-13测定 各组大鼠经3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，剖腹，分离腹主动脉取血，37℃水浴15min，3000r/min离心20min，取上部血清，保存于-20℃冰箱中。用ELISA法测定血清IL-13。

1.7.3气道上皮STAT 6蛋白检测 肺组织切片后用免疫组化法进行测定。光学显微镜下观察5个完整的气道横切面免疫组化图像，气道上皮细胞STAT 6阳性表达表现为胞浆和/或胞核黄色染色，对图像进行摄影，利用图像分析仪对图像进行分析，计算STAT 6蛋白的阳性表达单位（PU，positive unit）。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，数据以均数±标准差（）表示，各组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1各组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数比较 OVA组BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数较NULL组明显升高（P＜0.01）；DXM组和各剂量芍药甘草汤组白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数较OVA组减少（P＜0.01），但高于NULL组（P＜0.01）；SG2.5组白细胞总数和嗜酸性粒细胞计数高于DXM组和其他剂量SG组（P＜0.05）；DXM组与SG10、SG5组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.2各组血浆IL-13含量比较 OVA组血浆IL-13含量较NULL组升高（P＜0.01）；DXM组和各剂量芍药甘草汤组血浆IL-13较OVA组减少（P＜0.01）；DXM组IL-13含量低于不同剂量SG组（P＜0.05）；SG10、SG5、SG2.5组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 各组大鼠BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数比较（） ×107/L

表1 各组大鼠BALF中白细胞总数及嗜酸性粒细胞计数比较（） ×107/L

注：与NULL组比较，*P＜0.01；与OVA组比较，▲P＜0.01；与SG2.5组比较，△P＜0.05

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表2 各组大鼠血浆IL-13比较（）pg/mL

表2 各组大鼠血浆IL-13比较（）pg/mL

注：与NULL组比较，*P＜0.01；与OVA组比较，▲P＜0.01；与DXM组比较，☆P＜0.05

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2.3 各组大鼠气道上皮STAT 6蛋白表达 OVA组气道上皮STAT 6阳性细胞表达量明显高于NULL组（P＜0.01）；DXM组和不同剂量SG组阳性细胞表达量明显低于OVA组（P＜0.01）；DXM组和SG10、SG5组STAT6的阳性细胞表达量低于SG2.5组（P＜0.05）；DXM组与SG10、SG5组之间差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 各组大鼠气道上皮STAT6蛋白表达（）pg/mL

表3 各组大鼠气道上皮STAT6蛋白表达（）pg/mL

注：与NULL组比较，*P＜0.01；与OVA组比较，▲P＜0.01；与SG2.5组比较，△P＜0.05

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3 讨论

支气管哮喘是一种气道慢性变应性炎症性疾病,多种炎性细胞参与哮喘发病过程，目前认为嗜酸性粒细胞是哮喘气道炎症的主要效应细胞，大多数炎性细胞最终通过EOS产生效应[4]。IL-13是一种主要由活化的Th2细胞分泌的多效能细胞因子，可刺激细胞的增殖和合成，通过与肥大细胞、嗜酸性粒细胞的作用而诱发哮喘的急性发作。近年研究表明，IL-13可不依赖于IL-4、IgE及嗜酸粒细胞等传统途径而诱发哮喘的所有症状，因此，IL-13被认为是哮喘发病中极为重要的一种介质[5]。STAT 6是一种能被众多细胞外多肽类分子激活、参与基因转录调控的信号转导和转录激活因子，它通过JAK-STAT信号转导途径介导细胞因子IL-4、IL-13等的生物学活性。Akimoto等[6]研究发现，STAT 6基因缺陷小鼠（STAT 6-/-）吸入卵蛋白致敏后，肺泡灌洗液中未发现EOS浸润，肺组织、支气管黏膜、支气管周围组织未见炎症反应，气道反应性试验未见气道反应性增高。研究表明，STAT 6通过调节Th2优势应答促进B淋巴细胞增殖与分化、参与IgE的同种型转换，在支气管哮喘病理生理过程中起重要作用。

研究表明，芍药的主要成分芍药总苷是一种双向抗炎免疫调节药，而甘草的主要成分甘草次酸有明显的皮质激素样作用。Takagi[7]实验表明，甘草次酸抑制炎症反应的效价为氢化可的松的1/10。熊谷朗报道，甘草次酸能抑制IgE和组胺的合成从而发挥抗炎、抗过敏作用，而且芍药总苷和甘草次酸具有协同作用[8]。

本研究表明，芍药甘草汤可明显抑制哮喘大鼠的气道黏膜炎症和EOS浸润，同时降低IL-13水平和气道上皮STAT6表达，说明芍药甘草汤治疗哮喘的作用可能通过上述机制实现。

［1］曹艳，旺建伟，段淑香，等.芍药甘草汤临床及药理研究近况［J］.中医药信息，2006，23（3）：41-43.

［2］郑继生，钱景莉.芍药甘草汤及其临床运用［J］.河南中医，2012，32（8）：966-968.

［3］王洋，关炜，李韶妮.芍药甘草汤防治支气管哮喘机理研究［J］.山西中医，2011，27（9）：43-45.

［4］Lampinen M，Hakansson L，Venge P.Interleukin-2 inhibit eosinophil migration but is counteracted by IL-5 priming［1］.Clin Exp Allergy，2001，31（2）：249-258.

［5］Wills-Karp M，Luyimbazi J，Xu X，et al.Interleukin-13：central mediator of allergic asthma［J］.Science，1998，282（3597）：2258-2261.

［6］Akimoto T，Numata F，Tamura M，et al.Abrogation of bronchia Eosinophilic inflammation and airway hyperreactivity in signal transducers and activators of transcription（STAT）b-deficient mice［J］.J Exp Med，1998，187（9）：1537-1542.

［7］Takagi.Study of Glycyrrhiza uralensis［J］.International journal of Oriental Medicine 1989，14（4）：185.

［8］中国医科院药物研究所等.中药志［M］.北京：人民卫生出社，1993：183-184.

Effects of Shaoyaogancaotang on STAT6 and Interleukin-13 in Asthmatic Rats

Dong Lei1，CAI Wanru1，ZHU Shiping2. 1 Department of Respiratory Diseases,Xinhua Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310005),China；2 Department of Respiratory Diseases，Hangzhou Chinese Medical Hospital.

ObjectiveTo observe the effect of Shaoyaogancaotang（SG）on signal transducer and activator of transcription 6（STAT6）and interleukin-13 in asthmatic rat,and to explore the possible mechanism of SG to asthma.MethodsSixty SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group（group NULL）,asthmatic group（group OVA）,dexamethasone group（group DXM）,group SG10,group SG5,and group SG2.5.Before nebulization,group NULL and OVA was given saline of 10ml/kg intragastrically,group DXM was given DXM of 1 mg/kg,and groups SG were given SG of 10,5,and 2.5 g/kg,respectively.The numbers of total leukocytes and eosinophils in bronchoalveolar lavage fluid（BALF）were measured by light microscope.The protein expression of STAT6 in airway epithelium was shown by immunohistochemistry.The serum IL-13 were detected by ELISA.ResultsAfter sensitized and challenged,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF of OVA-treated rats significantly in creased compared with group NULL（P＜0.01）.After treatment with different dosages of SG and dexamethasone,the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF,the STAT6 protein expression,and serum IL-13 were significantly lower than those in group OVA（P＜0.01）,but higher than those in group NULL（P＜0.01）.ConclusionShaoyaogancaotang can significantly inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,decrease the IL-SG can inhibit the protein expression of STAT6 in pulmonary tissue,and decrease the serum IL-13 and the numbers of total leukocytes and eosinophils in BALF.SG might be of potential value in protection and treatment of asthma.

asthma；Shaoyaogancaotang；signal transducer and activator of transcription 6；interleukin-13

2013-09-20

浙江省中医药优秀青年人才基金计划（No.2012ZQ013）