ERCC1、BAG-1及BRCA1基因在非小细胞肺癌中的表达及其与预后的关系

阳 诺 马 辉 冼 磊 陈铭伍

作者单位：530021 南宁 广西医科大学第一附属医院心胸外科

临床研究

ERCC1、BAG-1及BRCA1基因在非小细胞肺癌中的表达及其与预后的关系

阳 诺 马 辉 冼 磊 陈铭伍

作者单位：530021 南宁 广西医科大学第一附属医院心胸外科

目的 探讨ERCC1、BAG-1和BRCA1基因mRNA在接受以铂类为基础辅助化疗的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者中的表达情况及其与预后的关系。方法 85例NSCLC患者中74例给予以铂类为基础的术后辅助化疗，采集全组患者的肿瘤组织和其中34例患者的癌旁组织，应用半定量RT-PCR法，检测其ERCC1、BAG-1和BRCA1基因mRNA的表达情况，回顾性分析患者的临床病理资料，探讨3个基因的表达与患者总生存期（OS）之间的关系。结果 ①ERCC1、BAG-1阴性表达的患者OS显著长于阳性表达的患者（P均=0.001）。ERCC1、BAG-1阴性表达的患者接受铂类化疗的疗效显著优于阳性表达的患者（P=0.002、P=0.001）。②BRCA1阴性表达的患者OS长于阳性表达的患者，但差异无统计学意义（P=0.057）。③多因素分析显示ERCC1、BAG-1可作为NSCLC患者接受铂类化疗的预后指标（P=0.027、P=0.022）。结论 检测ERCC1和BAG-1的表达可作为指导NSCLC患者术后接受铂类化疗及预后评估的指标。【关键词】肺肿瘤；非小细胞肺癌；ERCC1；BAG-1；BRCA1；化疗；预后

在我国肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，现已成为导致城乡居民癌症死因的首位。手术及辅助化疗是治疗肺癌的主要手段，但术后患者出现化疗耐药往往成为治疗失败的常见原因，从而导致患者的生存期较短。目前，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）术后化疗方案以铂类制剂（顺铂/卡铂）联合细胞毒性药物（如吉西他滨、长春瑞滨和紫杉醇等）为主。有研究表明NSCLC组织中切除修复交叉互补基因1（excision repair cross-complementing 1，ERCC1）、bcl-2结合抗凋亡基因1（bcl-2 associated athanogene-1，BAG-1）及乳腺癌和卵巢癌易感基因1（breast and ovarian cancer susceptibility gene 1，BRCA1）基因mRNA的表达将直接影响NSCLC患者予铂类制剂的治疗及预后。

本研究通过检测85例NSCLC患者癌组织和其中34例癌旁组织标本中ERCC1、BAG-1及BRCA1基因mRNA的表达情况，从基因层面回顾性分析其表达水平及以铂类为基础的化疗方案与NSCLC患者预后的关系，从而指导NSCLC患者术后化疗药物的选择。

1 材料和方法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象 收集2007年8月至2009年5月在广西医科大学第一附属医院心胸外科经手术切除并经病理确诊的85例NSCLC标本，患者年龄为24～84岁,其中鳞癌25例，腺癌60例。采用UICC 2003标准进行TNM分期，其中Ⅰ期＋Ⅱ期48例，Ⅲ期＋Ⅳ期37例。高、中分化58例，低分化27例。有淋巴结转移者28例，无淋巴转移57例。同时收集其中34例癌旁组织（癌组织外5cm的肺组织）作为对照。手术切除的新鲜组织离体后迅速贮于-80℃低温冰箱备用。术前全组患者均未接受放疗或化疗。85例患者中Ⅰb期11例，术后仅给予定期复查、随访，余74例均给予以铂类为基础的术后化疗方案化疗。本研究所有标本的取得均已签署知情同意书。

1.1.2 随访 总生存期（OS）为手术当日至随访截止日期（2011年6月1日），或因复发、转移导致死亡的日期。

1.2 半定量RT-PCR法检测NSCLC癌组织中3种基因的表达

NSCLC癌组织中ERCC1、BAG-1和BRCA1 mRNA的表达应用Trizol法提取总RNA（Trizol总RNA提取试剂购自美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒Revert AidTM First Strand cDNA购自美国Fermentas公司），总RNA经逆转录获得cDNA。检测的基因及内参引物均由上海捷瑞公司合成。ERCC1基因序列：上游引物为5′-CCCTGGGAATTTGGCGACGTAA-3′；下游引物为5′-CTCCAGGTACCGCCCAGCTTCC-3′，片段大小为273 bp。BAG-1基因序列：上游引物为5′-GGCAGCAGTGAACCAGTTG-3′；下游引物为5′-GCTATCTTCTCCACAGACTTCTC-3′，片段大小为242 bp。BRCA1基因序列：上游引物为5′-AAGGTTGTTGATGTGGAGGAG-3′；下游引物为5′-CAGAGGTTGAAGATGGTATGTTG-3'′，片段大小为208 bp。β-actin为内参基因：上游引物为5′-CTCGCGTACTCTCTCTTTCTGG-3′；下游引物为5′-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3′，片段大小为334 bp。PCR反应体系总体积为25 μl。反应条件：预变性94℃3 min 30 s，变性94℃40 s，退火温度为40 s，72℃延伸50 s，30个循环后，总延伸72℃5 min。取PCR反应产物各6 μl均匀上样于含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶中，以Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统拍照并记录。

预实验PCR产物送至北京诺赛基因组研究中心测序，将ERCC1、BAG-1和BRCA1基因片段的测序结果与NCBI（美国国立生物技术信息中心）中的Nucleotide Blast进行比对，结果完全匹配。然后采取同样的步骤进行大样本检测，β-actin为内参，不加模板的反应体系为阴性对照，以测序证实为ERCC1、BAG-1或BRCA1基因的产物为阳性对照，排除基因组DNA污染和排除假阴性，并将编号的试验结果随机抽样进行测序以确保大样本的准确性。将组织标本PCR扩增产物进行电泳，出现目的条带者为阳性表达，反之为阴性表达。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计软件处理分析实验数据。计数资料的比较采用χ2检验或Fisher′s确切概率法；采用KaPlan-Meier法进行单因素生存分析，以Cox回归模型进行多因素分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NSCLC癌组织中ERCC1、BAG-1、BRCA1基因的表达情况

从凝胶电泳图中可以看到大小约为273 bp、242 bp、208 bp及334 bp 4个条带，这与目的基因及内参基因测序结果一致，表明NSCLC癌组织中均存在3个基因的表达，内参稳定。见图1。

2.2 ERCC1、BAG-1和BRCA1的表达与患者临床病理特征的关系

ERCC1在85例NSCLC癌组织和34例癌旁组织中均有阳性表达，其阳性率分别为58.8%（50/85）和55.9%（19/34），差异无统计学意义（χ2=0.086，P=0.769）；BAG-1和BRCA1在NSCLC癌组织和癌旁组织中均有阳性表达，其阳性率分别为37.6%（32/85）、82.4%（28/34）（χ2=19.416，P=0.000）和16.5%（14/85）、44.1%（15/34）（χ2=9.265，P<0.05），差异均有统计学意义；ERCC1的表达与NSCLC的TNM分期（P=0.006）和淋巴结转移与否有关（P=0.01），而与患者性别、年龄、民族、组织学类型及分化程度等无关（P均>0.05）；BAG-1及BRCA1的表达与患者各临床病理特征均无关（P均>0.05）。见表1。

图1 ERCC1、BAG-1及BRCA1的凝胶电泳图（A为ERCC1；B为BAG-1；C为BRCA1）注：M.marker对照；1.β-actin内对照；2.阳性对照；3.空白对照；4～7.NSCLC癌组织；4、6.阳性表达；5、7.阴性表达。

表1 NSCLC患者ERCC1、BAG-1及BRCA1基因的表达与临床病理特征的关系（n）

2.3 ERCC1、BAG-1和BRCA1的表达与患者总生存期的关系

NSCLC患者OS为2.3～42.6个月，平均27.2个月。ERCC1、BAG-1阴性表达的患者其OS显著高于阳性表达的患者（＞42.6个月vs 19.7个月，P=0.001；32.3个月vs 15.2个月，P=0.002）（图2）；BRCA1基因的表达与患者的OS差异无统计学意义（P=0.057）。单因素分析发现ERCC1的表达（P=0.002）、BAG-1的表达（P=0.001）、TNM分期（P=0.008）和淋巴结转移与否（P=0.007）与患者OS相关，而BRCA1的表达与患者OS无明显相关，差异无统计学意义（P=0.057）。见表2。

将NSCLC患者ERCC1、BAG-1的表达、TNM分期和淋巴结转移等通过Cox回归模型进行多因素分析，结果表明ERCC1及BAG-1在肿瘤组织中的表达情况可独立影响NSCLC患者的预后（P均<0.05），而淋巴结转移和TNM分期与患者OS无明显相关（P均>0.05）。见表3。

图2 NSCLC患者ERCC1和BAG-1表达的总生存曲线注：A.ERCC1；B.BAG-1。

表2 NSCLC患者的临床病理特征及ERCC1、BAG-1、BRCA1的表达与患者OS的单因素分析

表3 NSCLC患者ERCC1、BAG-1的表达及临床病理特征与患者OS的多因素分析

3 讨论

目前，许多研究表明DNA修复能力与NSCLC的发生及化疗耐药密切相关，临床上仅依靠病理类型及临床分期来指导NSCLC患者的治疗及评估预后，其效果并不理想。因此，我们试图从基因层面找到一些与NSCLC密切相关的标志物，用以指导NSCLC的治疗及评估预后，以提高NSCLC的治疗效果。

ERCC1是人类第一个通过克隆得到的DNA损伤修复基因，它参与DNA链的切割及损伤识别，其表达量直接影响DNA修复的生理过程［1］。有研究表明，ERCC1在修复内源性或外源性致癌物质所导致的DNA损伤过程中发挥重要作用［2］。铂类化疗药物的药理作用主要是通过形成铂类-DNA加合物和两股DNA链的交联来发挥其细胞毒性，而ERCC1在铂类药物所诱导的细胞毒性过程中发挥关键作用［3］。有研究表明，在铂类耐药的NSCLC A549细胞株中，其ERCC1呈高表达［4］。ERCC1阳性表达患者的OS低于阴性表达的患者，且术后辅助化疗效果差于阴性表达的患者［5］。本研究检测85例NSCLC患者癌组织中ERCC1 mRNA的表达情况，发现ERCC1阴性表达的患者其OS显著高于阳性表达的患者（＞42.6个月vs 19.7个月），从而提示ERCC1的表达与NSCLC的预后密切相关。同时，本研究还发现ERCC1的表达和TNM分期及淋巴结转移与否密切相关，TNM分期越高，淋巴结转移越广泛，ERCC1表达的阳性率越高，提示ERCC1的表达与肿瘤的侵袭性及预后不良呈正相关，这与Ota等［6］的研究一致。但也有部分文献报道NSCLC患者癌组织中ERCC1呈阳性表达者可能有较好的预后［7，8］，这种差异可能是由于不同的实验过程、不同实验技术的选择和不同的地区差异等因素造成。

BAG-1是一种多功能调节蛋白，通过与多种基因蛋白产物相互作用来调节细胞的凋亡与增殖［9］。有研究表明，BAG-1在乳腺癌、NSCLC和结肠癌等肿瘤组织中呈阳性表达，而在正常组织中几乎不表达，BAG-1的表达与患者的预后不良呈正相关［10，11］，因此BAG-1可用于评估乳腺癌、NSCLC和结肠癌等多种肿瘤的预后。本研究我们发现BAG-1在NSCLC癌组织中的阳性表达率为37.6%（32/85），远低于癌旁组织的82.4%（28/34），说明BAG-1在癌组织中的抗凋亡作用明显下降，这可能成为肿瘤发展的因素之一。此外，我们还发现BAG-1呈阳性表达的患者其OS显著低于阴性表达的患者（15.2个月vs 32.3个月），提示BAG-1的表达可作为评估NSCLC患者预后的一个重要因素。同时，我们通过单因素分析，结果表明BAG-1的表达、TNM分期以及淋巴结转移与否等是影响NSCLC患者OS的因素，而其中BAG-1基因的表达是影响患者预后的独立因素，这与王伟强等［12］的研究结果一致。

BRCA1参与细胞有丝分裂的过程，在DNA的损伤修复中同样起着关键性的作用［13］。已有研究表明BRCA1在NSCLC患者预后中有潜在预测的作用［14］。在本研究中我们发现BRCA1阴性表达的患者其OS长于阳性者，但两者差异无统计学意义（P=0.057），这可能受限于随访时间和样本的数量所致，期待进一步探索和验证。

综上，ERCC1和 BAG-1的表达可作为指导NSCLC患者术后予铂类化疗及预后评估的一个重要参考指标，有关方面值得深入研究。

［1］ Croteau DL，Peng Y，Van Houten B.DNA repair gets physical：mapping an XPA-binding site on ERCC1［J］.DNA Repair（Amst），2008，7（5）：819-826.

［2］ Hwang IG，Ahn MJ，Park BB，et al.ERCC1 expression as a prognostic marker in N2（+）non-small cell lung cancer patients treated with platinum-based neoadjuvant concurrent chemoradiotherapy［J］.Cancer，2008，113（6）：1379-1386.

［3］ Azuma K，Komohara Y，Sasada T，et al.Excision repair cross-complementation group 1 predicts progression-free and overall survival in non-small cell lung cancer patients treated with pktinum-based chemotherapy［J］.Cancer Sci，2007，98（9）：1336-1343.

［4］ Booton R，Ward T，Ashcroft L，et al.ERCC1 mRNA expression is not associated with response and survival after platinum-based chemotherapy regimens in advanced non-small cell lung cancer［J］.J Thorac Oncol，2007，2（10）：902-906.

［5］ Li J，Li ZN，Yu LC，et al.Association of expression of MRPl，BCRP，LRP and ERCCl with outcome of patients with locally advanced nonsmall cell lung cancer who received neoadjuvant chemotherapy［J］. Lung Cancer，2010，69（1）：116-122.

［6］ Ota S，Ishii G，Goto K，et al.Immunohistochemical expression of BCRP and ERCC1 in biopsy specimen predicts survival in advanced non-small-cell lung cancer treated with cisplatin-based chemotherapy［J］.Lung Cancer，2009，64（1）：98-104.

［7］ Zheng Z，Chen T，Li X，et al.DNA synthesis and repair genes RRMl and ERCCl in lung cancer［J］.N Engl J Med，2007，356（8）：800-808.

［8］ Lee KH，Min HS，Han SW，et al.ERCCl expression by immunohistochemistry and EGFR mutations inresected non-small cell lung cancer［J］.Lung Cancer，2008，60（3）：401-407.

［9］ Li JJ，Ding Y，Li DD，et al.The overexpression of ERCC-1 is involved in the resistance of lung cancer cells to cetuximab combined with DDP［J］.Cancer Biology and Ther，2009，8（20）：1914-1921.

［10］Rorke S，MurPhy S，Khalifa M，et al.Prognostic significance of BAG-1 expression in non-small cell lung cancer［J］.Int J Cancer，2001，95（5）：317-322.

［11］Tang SC.BAG-1，an anti-apoptotic tumour marker［J］.IUBMB Life，2002，53（2）：99-105.

［12］ 王伟强，陈 军.BAG-1蛋白在人癌细胞中的表达和功能［J］.中国肺癌杂志，2008，11（3）：470-472.

［13］ Taron M，Rosell R，FeliP E，et al.BRCA1 mRNA expression levels as an indicator of chemoresistance in lung cancer［J］.Human Mol Genet，2004，13（20）：2443-2449.

［14］ Rosell R，Perez-Roca L，Sanchez JJ，et al.Customized treatment in non-small cell lung cancer based on EGFR mutations and BRCA1 mRNA experssion［J］.PLoS One，2009，4（5）：e5133.

［2013-11-29收稿］［2014-02-11修回］［编辑 阮萃才］

Expression and prognostic significance of ERCC1 BAG-1 and BRCA1 mRNA in non-small cell lung cancer

YANG Nuo，MA Hui，XIAN Lei，CHEN Ming-wu（Department of Cardiothoracic Surgery，First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

XIAN Lei.E-mail：xianlei59@163.com

Objective To investigate the expression and prognostic usefulness of ERCC1，BAG-1 and BRCA1 in patients with nonsmall cell lung cancer（NSCLC）treated with platinum-based adjuvant chemotherapy.Methods RT-PCR was used to investigate the mRNA expression of ERCC1，BAG-1 and BRCA1 in 85 samples of NSCLC tissues and 34 tumor-adjacent tissues.Relationships of the expression of these three genes with overall survival（OS）were analyzed.Results①OS was significantly longer in patients negative for ERCC1 or BAG-1 mRNA expression than in those positive for expression of either gene（P=0.001）.Platinum-based chemotherapy was more effective for patients negative for ERCC1 or BAG-1 than for the corresponding positive patients（P=0.001 and P=0.002），respectively.②OS may be longer in patients negative for BRCA1 mRNA expression than in BRCA1-positive patients（P=0.052）.③Multivariate analysis suggests that ERCC1 and BAG-1 may be prognostic indicators for patients receiving platinum-based adjuvant chemotherapy（P=0.027 and P=0.022）.Conclusion Expression of ERCC1 and BAG-1 mRNA may be useful in the prognosis of NSCLC treated with platinum.

Lung neoplasm；Non-small cell lung cancer；ERCC1；BAG-1；BRCA1；Chemotherapy；Prognosis

R734.2

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.06

广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻10124001A-44）；广西留学回国人员科学基金资助项目（桂科回0832011）；广西卫生厅科研基金资助课题（Z2011329）

冼 磊。E-mail：xianlei59@163.com