人肝癌细胞系中CD90+细胞的生物学特性

许 飒宁淑芳 利基林 冯 雁 唐艳萍 骆成飘 张力图

作者单位：530021 南宁 广西肿瘤防治研究所实验研究部；△广西医科大学研究生学院

基础研究

人肝癌细胞系中CD90+细胞的生物学特性

许 飒△宁淑芳 利基林 冯 雁 唐艳萍 骆成飘 张力图

作者单位：530021 南宁 广西肿瘤防治研究所实验研究部；△广西医科大学研究生学院

目的 筛选肝癌细胞系中CD90（Thy-1）阳性表达的细胞，初步探讨CD90+细胞亚群的干细胞特性。方法 利用流式细胞分选术筛选5种肝癌细胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及SK-Hep-1）中CD90（Thy-1）阳性表达的细胞，以平板克隆形成实验观察其增殖能力，CCK-8法观察CD90+细胞的增殖能力和顺铂对CD90+细胞的抑制率。结果 肝癌细胞株Sk-Hep-1中有66.02%的细胞CD90呈阳性表达。平板克隆形成实验显示CD90+细胞克隆形成率为（18.60±2.95）%，显著高于CD90-细胞及未分选细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。体外实验显示培养4 d后CD90+细胞的增殖较CD90-及未分选细胞明显加快；CD90+细胞在相同浓度的顺铂作用下其抑制率较CD90-细胞和未分选细胞明显降低，三者的抑制率分别为14.8%、29.7%和24.0%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 肝癌细胞中的CD90+细胞是具有肿瘤干细胞特性的细胞亚群，CD90可能是肝癌干细胞候选的分子标志物。

肝肿瘤；流式细胞分选术；CD90；Thy-1；干细胞；顺铂；抗药性，肿瘤；生物学特性

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC，简称肝癌）是世界上第六大常见癌症［1］，近年来虽然肿瘤的诊断和治疗技术在不断更新和发展，但肝癌死亡率仍居高不下，每年约有60万人死于此病，其死亡率在男性肿瘤中位居第二位［2］。肝脏切除术和肝移植是HCC主要的治疗方法［3］，但术后发生转移或复发的比例仍较高。1977年Hamburger等［4］在干细胞的理论基础上提出了“肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）”的概念，使人类对肿瘤有了更多新的认识。目前，我们对肝癌干细胞的研究还处于探索阶段。2008年Yang等［5，6］从肝癌组织中分离获得肝癌干细胞，在肝癌中发现了肿瘤干细胞的存在。本实验主要研究肿瘤干细胞的分选和肝癌细胞系中CD90的表达情况，并初步探讨CD90+细胞体外增殖、抗药性等特性，为进一步研究肝癌干细胞的生物学特性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

DMEM（高糖）、RPMI-1640和胎牛血清均购自美国Hyclone公司，盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液购自扬子江药业有限责任公司，鼠抗人CD90单克隆抗体购自美国eBioscience公司，5种肝癌细胞株（HepG2、SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403和Sk-Hep-1）由广西肿瘤防治研究所实验研究部提供。流式细胞分选仪为美国BD公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 肝癌细胞株的培养 肝癌细胞株HepG2用含10%胎牛血清和10 μl/ml盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的DMEM（高糖）培养基培养。余4种肝癌细胞株（SMMC-7721、Bel-7404、Bel-7403及Sk-Hep-1）分别用含10%胎牛血清、10 μl/ml盐酸左氧氟沙星的RPMI-1640培养基培养。细胞置于5%CO2、37℃恒温培养箱中传代培养。实验采用对数生长期的细胞作为研究对象。

1.2.2 流式细胞分选术（fluorescence-activated cell sorting，FACS）检测肝癌细胞株中CD90的表达 选取对数生长期的肝癌细胞株，用不含EDTA的0.25%胰酶分别消化，培养液终止消化，吹打、制备单细胞悬液，离心（1 000 r/min，5 min）去上清液，计数并调整每管细胞数量为1×107个细胞。用含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution，PBS）洗涤，离心，制备单细胞悬液，分别加入鼠抗人单克隆抗体CD90 5 μl，用PBS将终体积定至100 μl，室温避光孵育30 min，并设立阴性对照。用含2%胎牛血清的PBS洗涤细胞两次，离心去上清液，每管加入500 μl含2%胎牛血清的PBS吹打，制备单细胞悬液，过滤，以流式细胞分选仪检测细胞中CD90的表达量。

1.2.3 荧光显微镜下观察抗体标记的细胞 根据细胞表面标志物，利用FACS从Sk-Hep-1细胞株中分选出CD90+细胞。收集分选出的CD90+细胞，取适量细胞悬液滴于载玻片，避光静置20 min，待细胞沉淀后，利用荧光显微镜检测细胞的荧光表达情况。

1.2.4 CCK-8法检测细胞体外增殖能力 将分选获得的CD90+细胞、CD90-细胞和未分选的细胞，用无血清培养基稀释至1×104/ml，接种至96孔板，每孔0.2 ml，每孔设置8个平行孔，在37℃、5%CO2培养箱中培养，每2 d换1次液体，用CCK-8法分别在1 d、3 d、5 d、7 d测定各种细胞的增殖情况。

1.2.5 细胞耐药能力的比较 将CD90+细胞、CD90-细胞和未分选的细胞亚群，以2 500个细胞/孔接种至96孔板，每种细胞设置对照组和加药组，每组设8个复孔。轻轻晃动96孔板以混匀细胞，于恒温培养箱培养24 h后更换培养基，将每种细胞的加药组加入浓度为12 μmol/L的顺铂培养基200 μl，对照组加入等量不含顺铂的完全培养基，48 h更换1次相应培养基，96 h后采用CCK-8法检测A450值，计算抑制率。抑制率（%）=（A0-Am）/A0×100%。A0为对照组A450值，Am为加药孔A450值。

1.2.6 平板克隆形成实验 将流式细胞分选仪分选出CD90+细胞和CD90-细胞，在6孔板中接种1 000个细胞进行培养，每种细胞接种3个孔，轻轻晃动6孔板使细胞分布均匀，置于37℃、5%CO2培养箱中培养15 d左右。当出现肉眼可见的细胞克隆时，弃掉培养液终止培养，以PBS液轻洗3次，用吉姆萨染色15 min，流水缓慢冲洗染料，待孔板干燥后于显微镜下计数形成的克隆数（≥50个细胞为1个克隆）。平板克隆形成率（%）=形成的克隆数/接种细胞数× 100%。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行处理和分析。计量资料的比较用t检验，计数资料的比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FACS分选的结果

经FACS分选得出肝癌细胞株HepG2中CD90的阳性表达率为0.15%，Sk-Hep-1中CD90的阳性表达率为66.02%，其余细胞株均未检测到CD90的阳性表达。见图1。

2.2 荧光显微镜检测分选细胞的纯度

在荧光显微镜下观察分选后的CD90+细胞，CD90阳性表达的SK-Hep-1细胞在显微镜下可见95%以上细胞的细胞膜发出绿色荧光（图2）。表明本实验经FACS分选所获得细胞纯度较高。

2.3 CCK-8法检测细胞体外增殖的能力

CCK-8法检测CD90+细胞、CD90-细胞和未分选细胞的增殖能力。从图3可见，自培养的第3天开始，CD90+细胞的增殖快速，而未分选的细胞和CD90-细胞的增殖缓慢，到第7天，CD90+细胞、CD90-细胞和未分选细胞的A450值分别为1.056±0.027、0.567±0.019和0.805±0.021，CD90+细胞较后两者细胞的增殖明显加快，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 荧光显微镜下观察分选后CD90阳性表达的SK-Hep-1细胞（×200）

图3 CCK-8法检测CD90+细胞、CD90-细胞及未分选细胞的生长曲线

2.4 细胞耐药能力的比较

以CCK-8法对CD90+细胞、CD90-细胞和未分选细胞抵抗顺铂的能力进行检测。经12 μmol/L的顺铂培养4 d，3种细胞的生长抑制率分别为14.8%、29.7%和24.0%。CD90+细胞的抑制率明显低于其余两种细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 在12 μmol/L的顺铂作用下3种细胞的生长抑制率

2.5 平板克隆形成实验检测3种细胞的克隆形成数

实验结果显示，CD90+细胞的克隆形成率为（18.60±2.95）%，CD90-细胞的克隆形成率为（3.77±1.44）%，未分选细胞为（11.17±1.92）%，表明CD90+细胞的克隆形成率明显高于CD90-细胞和未分选细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 平板克隆形成实验检测3种细胞的克隆形成数

3 讨论

为了寻找患者体内肿瘤细胞的特异性疗法，因此对肿瘤干细胞的研究一直是热点课题［7］，而分选肿瘤干细胞是对干细胞特性研究的第一步。目前，鉴定肿瘤干细胞最权威的方法是确定肿瘤干细胞的特异性细胞表面的标志［8］。有研究表明CD90标志的细胞分子参与肝癌的发生和发展［9］，因此必须根据细胞标志分选出肿瘤干细胞。目前肝癌干细胞的分离方法主要有磁性激活细胞分选术（magnetic activated cell sorting，MACS）和FACS，后者也称荧光激活细胞分选术。MACS较简单且容易操作，但分离细胞的效率和精确度相对较低，适用于对分选细胞纯度要求相对较低的实验；FACS虽操作复杂，但分选后的细胞纯度和精确度较高，细胞回收率也相对较高，因此更适用于含量相对较低的细胞分选。这两种分选方法共同的特点均依赖于肿瘤干细胞的表面标志。因此本实验采用FACS分选CD90+细胞。

CD90是一种25~37 kDa的糖蛋白，通过甘油二酯（DAG）固定于糖磷脂酰肌醇（GPI）的C末端，附着在细胞膜的内侧面。CD90在细胞与细胞之间以及细胞与基质之间的相互作用、细胞的凋亡、黏附、迁移、肿瘤演进和纤维化都起到十分重要的作用［10］。Saalbach等［11］研究证实，Thy-1（CD90）是人类微血管内皮细胞活化的标志，它在肿瘤细胞血行转移过程中可能起某种作用。另外，Herrera等［12］的研究表明，CD90表达于肝干细胞/肝祖细胞中（hepatic stem/progenitor cells，HSPCs）。2008年Yang等［5，6］成功地从肝癌组织中分离获得肝癌干细胞，并证明表达CD90的肝癌细胞具有自我更新、多向分化和高致瘤性，是肝癌干细胞的特异性标志物。本实验从肝癌细胞株SK-Hep-1中筛选出CD90+细胞，其CD90的阳性表达率为66.02%，这与 Yamashita等［13］研究肝癌细胞株SK-Hep-1中CD90阳性表达率为59.00%的数据相近。

本实验成功地从肝癌细胞系中分选出CD90+细胞，并用免疫荧光染色法对分选细胞进行纯度评估，结果表明通过FACS分选可获得高纯度的CD90+细胞。实验中对CD90+细胞、CD90-细胞及未分选细胞的生长曲线进行分析以及平板克隆形成实验，结果表明CD90+细胞的增殖能力及克隆形成能力均高于CD90-细胞及未分选细胞，这与文献［14］报道的结果一致；在抗药性实验的研究中，CD90+细胞的抗药性明显比CD90-细胞和未分选的细胞强，这与以往的研究结果相似［15］。由此说明肝癌细胞中的确存在一部分细胞的生物学特性与其他细胞不同。本实验经FACS分选的SK-Hep-1细胞株中CD90的阳性表达率高于HepG2中CD90的阳性表达率，而其余3株肝癌细胞均未检测到CD90的阳性表达，可能与细胞不同的生物学特性有关，有关方面值得深入研究。

本实验通过FACS从5种肝癌细胞株中筛选出CD90+细胞，并进行了一系列体外实验。结果表明CD90+细胞具有生长迅速、克隆形成率高和抗药性强等肿瘤干细胞的特点。今后我们将筛选出的细胞亚群接种于裸鼠体内，观察各细胞亚群的体内成瘤能力等特性，为肝癌干细胞的进一步研究奠定基础。

［1］ Forner A，Llovet JM，Bruix J.Hepatocellular carcinoma［J］.Lancet，2012，379（9822）：1245-1255.

［2］ Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

［3］ Mazzaferro V，Regalia E，Doci R，et al.Liver transplantation for the treatment of small hepatocellular carcinomas in patients with cirrhosis［J］.N Engl J Med，1996，334（11）：693-699.

［4］ Hamburger AW，Salmon SE.Primary bioassay of human tumor stem cells［J］.Science，1977，197（4302）：461-463.

［5］ Yang ZF，Ngai P，Ho DW，et al.Identification of local and circulating cancer stem cells in human liver cancer［J］.Hepatology，2008，47（3）：919-928.

［6］ Yang ZF，Ho DW，Ng MN，et al.Significance of CD90+cancer stem cells in human liver cancer［J］.Cancer Cell，2008，13（2）：153-166.

［7］ Mishra L，Banker T，Murray J，et al.Liver stem cells and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2009，49（1）：318-329.

［8］ Lapidot T，Sirard C，Vormoor J，et al.A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice［J］.Nature，1994，367（6464）：645-648.

［9］ 张珍妮，匡志鹏，杨 帆，等.肝癌干细胞标志CD90在化学诱癌过程中的动态变化［J］.中国癌症防治杂志，2012，4（2）：127-130.

［10］Rege TA，Hagood JS.Thy-1 as a regulator of cell-cell and cell-matrix interactions in axon regeneration，apoptosis，adhesion，migration，cancer，and fibrosis［J］.Faseb J，2006，20（8）：1045-1054.

［11］ Saalbach A，Hildebrandt G，Haustein UF，et al.The Thy-1/Thy-1 ligand interaction is involved in binding of melanoma cells to activated Thy-1-positive microvascular endothelial cells［J］.Microvasc Res，2002，64（1）：86-93.

［12］Herrera MB，Bruno S，Buttiglieri S，et al.Isolation and characterization of a stem cell population from adult human liver［J］.Stem Cells，2006，24（12）：2840-2850.

［13］ Yamashita T，Honda M，Nakamoto Y，et al.Discrete nature of EpCAM+and CD90+cancer stem cells in human hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2013，57（4）：1484-1497.

［14］王海丽，文 忠，申聪香，等.人鼻咽癌CD133+干细胞的生物学特性及意义［J］.中国组织工程研究，2012，16（6）：1007-1010.

［15］Zhu Z，Hao X，Yan M，et al.Cancer stem/progenitor cells are highly enriched in CD133+CD44+population in hepatocellular carcinoma［J］. Int J Cancer，2010，126（9）：2067-2078.

［2014-01-05收稿］［2014-02-25修回］［编辑 阮萃才］

Biological Characteristics of CD90+Cells in Human Hepatocellular Carcinoma Cell Lines

XU Sa△，NING Shu-fang，LI Ji-lin，FENG Yan，TANG Yan-ping，LUO Cheng-piao，ZHANG Li-tu（Department of Research，Guangxi Cancer Institute；△Graduate School of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

ZHANG Li-tu.E-mail：zhanglitu@gmail.com

Objective To isolate CD90+（Thy-1+）cells from human hepatocellular carcinoma（HCC）cell lines and to study their stem cell properties.Methods Fluorescence-activated cell sorting was used to detect CD90 expression in five HCC cell lines：HepG2，SMMC-7721，Bel-7404，Bel-7403 and SK-Hep-1.The tablet clone formation test was used to measure the colony-forming ability of the sorted CD90+cells，and the CCK-8 assay was used to analyze their proliferation ability and their sensitivity to cisplatin.Results CD90 expression was detected in 66.02%of Sk-Hep-1 cells.The pelletizing rate of these CD90+cells was（18.6±2.95）%in the tablet colony formation assay，significantly higher than that of CD90-and unsorted cells（P＜0.05）.Proliferation after 4 days in culture was significantly greater for CD90+cells than for CD90-and unsorted cells.Cisplatin inhibited growth of CD90+cells by 14.8%，significantly less than it inhibited the growth of CD90-cells（29.7%，P＜0.05）and unsorted cells（24.0%，P＜0.05）.Conclusion CD90+cells are a subpopulation with tumor stem cell properties.CD90 may be a candidate biomarker for HCC stem cells.

Hepatocellular neoplasm；Fluorescence-activated cell sorting；CD90；Thy-1；Stem cell；Cisplatin；Drug resistance，neoplasm；Biological characteristics

R735.7

A

1674-5671（2014）01-05

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.01.03

广西科学研究与技术开发计划课题（桂科攻1355005-3-10）；广西医科大学青年科学基金项目（GXMUYSF201215）

张力图。E-mail：zhanglitu@gmail.com