产自Bacillus sp.的热稳定偶氮还原酶结构模型研究

朱 超， 解井坤， 花 莉， 杨 冰, 沈 烁

(1.陕西科技大学 资源与环境学院， 陕西 西安 710021； 2.同济大学 环境科学与工程学院， 上海 200092)

0 引言

偶氮染料是一类由偶氮发色基团(-N=N-)联接的芳香类化合物，因其功能多样而被广泛地应用于纺织、制革、塑料制造、印染、造纸、制药和化妆品制造等产业[1,2].由于偶氮染料分子的高毒性和致癌性，其工业源排放对公共健康造成极大的威胁[3,4].

偶氮键的断裂是偶氮染料分子细菌降解的前提，细菌通过偶氮还原酶来转移电子攻击偶氮键使其断裂.虽然偶氮染料在有氧条件下不易被细菌所利用，但一些细菌种群能够通过产生氧不敏感或好氧偶氮还原酶来进行偶氮染料的脱色降解.部分细菌在厌氧和好氧条件下,均能进行偶氮键的还原，从而产生有机胺类，这些胺类之后在各类氧化酶的催化下进一步完成降解[5].

偶氮还原酶是偶氮染料降解菌表达的关键酶[6,7]，在染料污染区域的生物修复方面具有独特优势[8].尤其是具备热稳定性的偶氮还原酶，由于可施用于高温环境而具备极高的工业污水治理价值.Bacillusthuringiensis产偶氮还原酶(A0RCS1)是一类碱性热稳定偶氮还原酶，具有233个氨基酸残基，分子量为61.6 KD，其活性最高耐受温度可达80 ℃[9]，故其是研究偶氮还原酶酶热稳定性和蛋白结构关系的理想对象.

目前,研究者对蛋白质耐热性机制存有不同的看法和见解，缺乏统一普遍的规律.已有研究显示，与蛋白质热活性密切相关的因素有很多种，且往往是由这些因素共同作用的结果.其中，比较重要的影响因素有：氨基酸组成、二肽组成、氢键、盐桥等[10].蛋白质的氨基酸组成一直被认为是影响蛋白质热稳定性的关键因素之一.

为了进一步了解此类偶氮还原酶的热稳定机制，以及研究如何提高蛋白质的热稳定性，本研究基于蛋白质序列特征和结构特征分析了产自Bacillussp.的热稳定偶氮还原酶的特性，依据预测率确定了各种因素对蛋白质热稳定性影响的大小，并寻找了合适的蛋白质耐热性同结构关系验证的试验方法.另外，通过偶氮还原酶变性和温差脱色试验验证，进一步探讨了热稳定偶氮还原酶的蛋白质结构同其热稳定性的关系.本研究有利于人们深入理解蛋白质的折叠、结构与功能关系，还有助于进一步通过蛋白质工程等手段来改造获得具有独特生物学特性、更稳定高效的热稳定偶氮还原酶类.

1 材料和方法

1.1 序列获取和基础分析

从UniProt数据库获得已测定氨基酸序列的偶氮还原酶登录号等信息，根据产酶生物的不同对上述偶氮还原酶进行筛选，保留产酶生物为Bacillus的偶氮还原酶氨基酸序列，再依据其是否为FMN依赖型热稳定性偶氮还原酶做进一步筛选.

为了评估序列的一致性和保守性，本研究以偶氮还原酶STA(UniProt登录号，A0RCS1)的氨基酸序列为标准，分别通过NCBI数据库BLAST软件和ClustalX1.83对所得偶氮还原酶的氨基酸序列进行局部比对和全局比对[11].之后，再进一步使用TGREASE算法[12]分析偶氮还原酶STA的一级结构，预测其理化性质.

1.2 STA二级结构分析

通过TMHMM软件，对偶氮还原酶STA进行二级结构预测，获取相关的螺旋信息、跨膜区域等相关信息，为接下来的偶氮还原酶三级结构模型的构建与评价打下基础[13,14].

1.3 STA三维模型构建

本研究采用同源建模法[15-17]进行STA三维蛋白模型的构建,具体如下：

①获取产自Bacillussp.的热稳定偶氮还原酶的碱基序列,以及编码蛋白的氨基酸序列.

②通过PDB数据检索获取同产自Bacillussp.的热稳定偶氮还原酶序列一致性(≥40%)最高的已确定结构的蛋白质，再将已知蛋白质结构作为产自Bacillussp.的热稳定偶氮还原酶的结构模型模板，根据同源建模方法得到想要建立的蛋白质三维结构模型.

③分别通过Pole Biolnformatique Lyonnais和SWISS-MODEL同源建模方法，构建产自Bacillussp.的热稳定偶氮还原酶的三维结构模型.

1.4 模型评价与特性分析

通过UCLA对上述构建的两个偶氮还原酶STA的空间模型进行一系列分析，并将分析结果进行比较，取各项指标相对较好的模型作为偶氮还原酶STA的三维空间模型.通过PROCHECK程序[18,19],我们可以获得偶氮还原酶STA模型的一系列立体化学参数，并且能以直观的彩图输出部分结果.

该方法的原理主要是通过对蛋白质数据库中高分辨的蛋白晶体结构的参数进行整理，以作为标准参数，再将输入蛋白结构所具有的参数与标准参数进行对比，如果两者差异显著，则说明输入的蛋白结构存在明显问题.其输出结果包括：Ramachandran图、主链的键长与键角、二级结构图、平面侧链与水平面之间的偏离程度等.

1.5 决定Bacillus sp.偶氮还原酶热稳定性的结构因素分析

为了能够结合上述结构分析结果，进一步阐明决定Bacillussp.偶氮还原酶热稳定性的结构因素，我们设计了下面的实验进行验证：

①富集偶氮染料脱色菌株Bacillussp.T7，并进行偶氮还原酶粗酶的提取[20].

②对粗提酶进行结构针对性的变性.选用SDS(十二烷基磺酸钠)(1 mmol/L)和甲醇(5%，V/V)等分别破坏酶蛋白的氢键和疏水相互作用.

考察30 ℃、40 ℃和50 ℃恒温培养下添加了原酶和变性后酶对金橙溶液(12 mg/L)的脱色效果.经48 h恒温培养后，使用紫外-可见分光光度计对样品进行200～800 nm全波长扫描，并计算脱色率.对50 ℃下样品进行每1 h一次的跟踪测定并记录结果.

2 结果与讨论

2.1 氨基酸序列分析

氨基酸残基序列是决定蛋白质结构和功能的基础，通过氨基酸序列比对可知不同蛋白氨基酸残基序列的一致性和保守型.其中,一致性指两个序列保守不变的区域；保守性指序列中某个位置的氨基酸发生了改变，但保留了原来残基的物理化学性质.

搜索数据库UniProt，得到偶氮还原酶STA的氨基酸序列.使用BLAST，以偶氮还原酶STA氨基酸序列为标准，分析了筛选的19种产自Bacillus的偶氮还原酶的一致性，其结果如表1所示.比对结果显示，同STA相比较，多数偶氮还原酶序列相似性较低(21%～44%)，仅有STA-5与STA高度相似(99%).这说明即使是同属微生物产生的偶氮还原酶也存在较大的差异，也说明了热稳定性偶氮还原酶氨基酸残基的多态性.

表1 偶氮还原酶氨基酸序列一致性分析

使用ClustalX1.83对19种偶氮还原酶进行保守型分析，结果如图1所示.由图1可知，即使存在氨基酸残基的差异，但是不同Bacillus偶氮还原酶之间还是存在一定的保守性(不同颜色标出).暗示氨基酸残基的多样性,并未影响偶氮还原酶结构的保守型，以及由此决定的折叠后蛋白结构和功能.

图1 偶氮还原酶氨基酸序列保守型

2.2 STA一级结构分析

使用TGREASE算法，我们对偶氮还原酶STA进行了一级结构分析，如图2所示.结果显示，偶氮还原酶STA的分子量约为25 907D，而C、H、N、O、S各元素含量分别为54.19%、7.00%、15.83%、21.99%、0.99%.STA由20种氨基酸组成，其中含量最高的为谷氨酸，含量为9.40%;其次为缬氨酸，含量为9.00%;含量最低的氨基酸是组氨酸，其含量为0.40%.

图2 偶氮还原酶STA氨基酸组成

以氨基酸序列为横坐标，以各氨基酸亲疏水性得分为纵坐标，得到图3.其中，以得分为0作为界线，得分越大疏水性越强，得分越小亲水性越强.比较0线以上曲线同0线围成的面积和0线以下曲线同0线围成的面积，我们可以得出:0线以下曲线同0线所围成的面积大于0线以上曲线同0线围成的面积.结合STA一级结构中亲水性氨基酸占全部残基序列的比例大于疏水氨基酸所占整条氨基酸序列的比例，可知偶氮还原酶STA为亲水性蛋白质，其氢键作用强.

图3 偶氮还原酶STA亲疏水性分析

2.3 STA二级结构分析

本研究通过TMHMM软件,对目标蛋白进行跨膜区分析，结果如图4所示.图4中横坐标表示氨基酸残基，纵坐标为可信度.其中,紫色和蓝色细线分别表示定位于膜外和膜内的氨基酸残基；红色细线构成的柱子表示属于跨膜区的氨基酸残基，柱子的高度越高可信度越高，一般柱高大于0.5才有参考价值，柱高小于0.5的，可信度差，一般忽略.本分析结果第一柱高约为0.8，为可信跨膜区，即从118到140的中间23个氨基酸对应该蛋白质的跨膜区.

图4 偶氮还原酶STA跨膜区分析

使用EXPASY中TMPRED算法，对偶氮还原酶STA进行螺旋分析，结果如图5所示.图5中横坐标表示氨基酸序列，纵坐标表示在每个氨基酸残基螺旋构成判定的得分情况,实线表示氨基酸内-外螺旋评价的得分，虚线表示氨基酸外-内螺旋评价的得分.当得分为负数时，表明此处对应的氨基酸残基不属于该蛋白质跨膜区;当得分为正时，表示此处对应的氨基酸残基属于该蛋白质的跨膜区;当得分大于500时，可信度较高，一般认为一定有螺旋结构存在.

由图5可知，偶氮还原酶STA氨基酸具有两个螺旋结构.在118到139处，内-外螺旋评价得分为1278，外-内螺旋评价得分为1 374，所以该部分氨基酸属于外-内螺旋结构；在183到205处,内-外螺旋评价得分为906，外-内螺旋评价得分为618，所以该部分氨基酸属于内-外螺旋结构.综合可知，偶氮还原酶STA的跨膜螺旋区在第118到139个氨基酸部分，且该部分属于外-内螺旋结构.

图5 偶氮还原酶STA的螺旋结构分析

2.4 STA三维结构模型的构建与评价

本文使用3P0R 作为模板，通过Pole Biolnformatique Lyonnais和SWISS MODEL等两种方法，进行偶氮还原酶STA三维模型的构建工作.经模型评价后，得出SWISS MODEL法构建的三维模型更为可信，此处只展示基于SWISS MODEL法的STA三维模型和评分结果.

图6为偶氮还原酶STA的蛋白质三维结构图.其中,图6(a)和图6(b)为不同角度展示的蛋白双体图,图6(c)为结合了氨基酸残基键角键长的蛋白双体理论图，图6(d)为STA蛋白单体展示图.

可以得知，偶氮还原酶STA单体呈α/β结构，分子中含有五个α-螺旋，五个β-折叠，螺旋与折叠交替出现.五个β-折叠相互平行，形成一个平面，位于分子的中间；α-螺旋分列于平面的两侧，一侧两个，另一侧三个.

a b

c d图6 基于SWISS MODEL构建的 STA蛋白的三维结构模型

表征蛋白质主链二面角允许值范围的图形称为Ramachandran图(圈中红色、黄色及灰色分别代表氨基酸残基一面角分布的最适区、额外允许区及一般允许区)，其在生物信息学中常用来验证结构模型的可靠性.

如图7可知，模型中所有氨基酸残基均分布在允许的范围内，无不允许残基位置出现.位于最适区的残基(A，B，L)共333个，占总残基数的92.0%，位于额外允许区的残基(a, b,l,p)共26个，占总残基数的7.2%，位于一般允许区域的残基(-a,-b,-l,-p)共3个，占残基数的0.8%，没有残基位于不允许区域.总残基数为416个，其中,含有非甘氨酸和非脯氨酸残基362个，末端残基(Gly和Pro除外)4个，甘氨酸残基(以▲表示)30个，脯氨酸残基20个.这表明该模型中蛋白质主链残基的二面角的构象合理，上述数据亦表明模型较为合理，能够反映该酶的结构信息.

图7 基于SWISS MODEL构建的STA 蛋白质三维模型的Ramachandran评价图

2.5 STA的热稳定性和结构的关系

蛋白质的热稳定性与其性质、结构等密切相关，通常的影响因素有疏水相互作用、二硫键作用、氢键作用和离子键作用等.已有研究表明[21]，疏水作用对蛋白质的热稳定性贡献在60%左右，而氢键对蛋白质的热稳定性贡献在40%左右.

根据STA的氨基酸序列分析结果，STA不含有半胱氨酸，即不会有二硫键形成.因此，影响该蛋白质热稳定性的主要因素是疏水相互作用和氢键作用.在水介质中，球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部，这一现象被称为疏水相互作用.通过对偶氮还原酶STA二级结构分析和三维空间结构模型的构建，可以得到，偶氮还原酶STA是一种呈α/β三明治结构的球状蛋白质.由于其所拥有的球状结构使得该蛋白质的疏水基团紧紧地包裹在蛋白质内部，亲水基团暴露在蛋白质外层.因此，偶氮还原酶STA的热稳定性主要是因为其强烈的氢键作用，以及较强的疏水相互作用所引起的.

2.6 偶氮还原酶变性后脱色试验分析

为验证基于生物信息学分析对STA热稳定性和结构的关系的推论，我们进行了产自Bacillussp. 的偶氮还原酶粗酶的提取，并进行了选择性变性和随后的脱色活性测试.

图8反映的是50 ℃下添加不同变性酶的甲基橙溶液随时间的脱色率变化.由图8可知,随时间的推移,各处理脱色率均有所增加.其中,添加粗酶提取物的试样脱色率最好，厌氧和好氧驯化所得酶的最终脱色率分别为43.8%和47.0%;添加SDS变性酶的试样脱色率最低，厌氧和好氧试样最终脱色率分别为10.9%和10.2%;添加甲醇变性后酶的试样脱色率介于前两者之间，厌氧和好氧试样最终脱色率分别为37.6%和35.1%.

图8 50 ℃下不同变性酶 对甲基橙溶液的脱色率

图9反映的是在不同温度下添加不同变性后酶的处理对甲基橙溶液的脱色能力.在48 h反应期内，随着温度升高，各处理脱色率均有所增加.其中,添加粗酶提取物的试样脱色率变化最大，添加甲醇变性酶的试样脱色率变化较前者低，添加SDS变性酶的试样脱色率变化不大.50 ℃下，添加粗酶提取物的甲基橙溶液脱色率最高，厌氧和好氧试样最终脱色率分别为78.14%和77.13%；添加SDS变性酶的甲基橙溶液脱色率最差，厌氧和好氧试样最终脱色率分别为61.6%和78.14%；添加甲醇变性酶的脱色率介于前两者之间，厌氧和好氧试样最终脱色率分别为73.9%和72.78%.

图9 不同温度下不同变性酶 对甲基橙溶液的脱色率

由于SDS是通过作用于蛋白质的氢键来破坏蛋白质的结构，甲醇是通过影响蛋白质的疏水相互作用来影响蛋白质的稳定性，因此，可以得知,影响偶氮还原酶STA热稳定性的主要因素为其强烈的氢键作用和较强的疏水相互作用.这一点同偶氮还原酶STA的生物信息学分析结果是一致的.

3 结论

本研究在分析了产自Bacillussp.的热稳定偶氮还原酶STA的生物信息学基础上，通过向偶氮染料溶液中添加不同的变性酶，探讨了影响偶氮还原酶STA热稳定性的因素.主要结论为：

偶氮还原酶STA是一种不含有二硫键的亲水性蛋白质；STA在第118到139个氨基酸处存在跨膜螺旋结构，为内-外螺旋；基于SWISS MODEL构建的模型显示,STA的单体具有类似黄素氧化还原蛋白的α/β型结构；影响偶氮还原酶STA热稳定性的主要因素是蛋白质的疏水相互作用和氢键作用.

[1] Blumel S.,Busse H.J.,Stolz A.,et al.Xenophilus azovoransgen.nov.,sp.nov.,a soil bacterium able to degrade azo dyes of the orange II type[J].Int J Syst Evol Bacteriol,2001,51(5):1 831-1 837.

[2] Suzuki Y.,Yoda T.,Ruhul A.,et al.Molecular cloning and characterization of the gene coding for azoreductase fromBacillussp. OY1-2 isolated from soil[J].J Biol Chem, 2001,276(12):9 059-9 065.

[3] Bisschops I.,Spanjers H.Literature review on textile wastewater charactreisation[J].Environ Technol,2003,24(11):1 399-1 411.

[4] Weisburger J.H..Comments on the history and importance of aromatic and heterocyclic amines in public health[J].Mutat Res,2002,507:9-20.

[5] Stolz A.Basic and applied aspects in the microbial degradation of azo dyes[J].Appl Microbiol Biotechnol,2001,56(1-2):69-80.

[6] Lang W.S.,Ngiwsara L.,Mendes S.,et al..Characterization of a new oxygen-insensitive azoreductase from Brevibacillus laterosporus TISTR1911:Toward dye decolorization using a packed-bed metal affinity reactor[J].Bioresour Technol,2013,150:298-306.

[7] Santosh A.M.,Devendra P.L.,Mahendra N.L.,et al.Enzymatic transformation of nitro-aromatic compounds by a flavin-free NADH azoreductase from Lysinibacillus sphaericus[J].Biotechnol Lett,2013,36(1):127-131.

[8] Kolekar Y.M.,Nemade H.N.,Markad V.L.,et al.Decolorization and biodegradation of azo dye,reactive blue 59 by aerobic granules[J].Bioresour Technol,2012,104:818-822.

[9] Maier J.,Kandelbaue A.,Erlacher A.,et al.A new alkali-thermostable azoreductase fromBacillussp.strain SF[J].Appl Environ Microbiol,2004,70(2):837-844.

[10] Razvi A.,Scholtz J.M.Lessons in stability from thermophilic proteins [J].Protein Sci,2006,15(7):1 569-1 578.

[11] Saravanan P.,Vikash K.D.,Sanjukta P.In silico characterization of thermoactive,alkaline and dtergent-stable lipase from a staphylococcus aureus strain[J].Silico Biology,2010,10(5):265-276.

[12] Kyte J.,Doolittle R.A simple method for displaying the hydropathic character of a protein[J].J.Mol.Biol,1982,157:105-132.

[13] 石鸥燕，蔡春泉，孙 伟，等.结合蛋白质二级结构信息预测蛋白质空间结构中的二硫键[J].计算机应用研究,2011，28(6)：2 049-2 077.

[14] 张海霞，唐焕文，张立震，等.蛋白质二级结构预测方法的评价[J].计算机与应用化学,2003，20(6)：735-740.

[15] 柳广飞.偶氮还原酶AZR的结构模型与功能研究[D].大连：大连理工大学,2009.

[16] 柳广飞，周集体，王 竞，等.Rhodobacter sphaeroides偶氮还原酶三级结构同源建模与分析[J].大连理工大学学报,2010，50(2)：171-175.

[17] 谌 容，陈 敏，杨春贤，等.基于SWISS-MODEL的蛋白质三维结构建模[J].生命的化学,2006，26(1)：54-56.

[18] Laskowski R.A.,Mac Arthur M.W.,Moss D.S.,et al.PROCHECK-aprogram to check the stereochemical quality of protein structures[J].J.App.Cryst,1993,26:283-291.

[19] Laskowski R A.,Rullmannn J.A.,Mac Arthur M.W.,et al.AQUA and PROCHECK-NMR: programs for checking the quality of protein structures solved by NMR[J].J Biomol,1996,8(4):477-486.

[20] 宋志勇.偶氮染料高效降解基因工程菌构建与特性研究[D].大连：大连理工大学，2006.

[21] 田 健，王 平，伍宁丰，等.理性设计提高蛋白质热稳定性的研究进展[J].生物技术进展,2012，2(4)：233-239.