响应面法优化Nisin发酵的培养条件

贺小贤， 郑茂奎， 刘 欢， 彭光杰

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

乳链菌肽(Nisin)是一种由乳酸链球菌代谢产生的具有很强杀菌作用的细菌素,是食品和药物管理局(FAD)和世界卫生组织(WTO)允许商业化生产的食品添加剂[1].它能够有效抑制大部分革兰氏阳性细菌(G+)以及芽孢杆菌的孢子的繁殖，特别对金黄色葡萄球菌、溶血链球菌的作用明显[2].目前，乳链菌肽广泛用于罐装食品、植物蛋白食品、酒精饮料、乳制品和肉制品等的保藏中[3].

乳链球菌发酵Nisin的能力，除了受菌株自身特性的影响，还受到发酵条件的影响，如发酵温度[4]、搅拌速率、接种量[5]等.为了提高乳酸菌发酵生产Nisin的能力，国内外许多研究者对发酵法生产Nisin进行了研究.

赵春燕[6]等研究乳酸链球菌菌株(Lactococculactissubsp.lactics) W4生产乳链菌肽的条件以及影响因素，通过单因素实验研究碳源、氮源、磷酸盐、金属离子和发酵条件，结果认为葡萄糖是W4菌株发酵的最佳碳源，酵母膏为最佳氮源，K2HPO4、Fe2+、Mg2+对其发酵有促进作用，而Cu2+有强抑制作用.初始pH6.5、2%接种量、35 ℃下振荡培养有利于W4菌株生长和Nisin的产生.

白泽朴[7]等研究了乳酸乳球菌乳酸亚种T0625菌株生产Nisin的最佳培养条件，即装液量250 mL、接种量7 %、起始pH 6.5、培养温度35 ℃，Nisin的抑菌活性达到最大.

Saeed Mirdamadi[8]等通过正交试验对乳酸链球菌菌株(Lactococcuslactissubsp.lactis)ATCC 11454发酵条件进行优化，在装液量75 mL/250 mL、初始pH8、接种量为1%、搅拌速率100 r/min、接种龄24 h、温度30 ℃、发酵时间32 h，Nisin的最大活性为606 IU/mL.

诸多优化主要采用正交试验法，而采用响应面分析法优化乳链菌肽发酵条件和加工工艺参数报道较少.为了获得嗜热乳链球菌发酵生产Nisin的工艺条件，提高效价，在单因素实验的基础上，采用中心组合(Box-Behnken)试验设计及响应面分析发酵初始pH、接种量和玉米浆添加量对Nisin发酵的影响，并对参数进行优化，最终得到二次回归方程并确定最佳的发酵参数，为Nisin的发酵研究提供一定的参考.

1 材料与方法

1.1 原料

1.1.1 菌株

Nisin发酵菌株:嗜热乳链球菌6032(Streptococcus Thermophilus)，本研究室保藏菌种；效价检测菌株：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，本研究室保藏菌种.

1.1.2 培养基

(1)菌种活化培养基：脱脂乳培养基，105 ℃～108 ℃灭菌20 min.

(2)种子培养基：CM[9]培养基.

(3)发酵培养基(g/L)：葡萄糖10.0，酵母粉5.0，蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，硫酸镁0.58，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸二铵2.0，乙酸钠5.0，硫酸锰0.25，吐温80 2.0 mL，pH6.5，玉米浆按照体积比添加，121 ℃，灭菌20 min.

(4)效价检测培养基(g/L)：蛋白胨8.0，葡萄糖5.0，酵母浸粉2.5，磷酸氢二钠2.0， 氯化钠5.0，琼脂粉10.0，pH7.2～7.4，121 ℃，灭菌20 min.

1.1.3 试剂

Nisin标准品，美国Sigma公司.

玉米浆，干物质≥50.0%，pH值3.5～4.0，来自陕西宝鸡阜丰生物科技有限公司.

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

脱脂乳培养基活化乳酸链球菌，活化3次备用.

1.2.2 种子培养

活化菌种接入种子培养基，35 ℃培养18 h，菌体浓度6.7×109CFU/mL.

1.2.3 分批发酵

将种子液接入发酵培养基中，接种量5.0%，30 ℃静止培养20 h，发酵液pH调至2.5，5 400 r/min离心12 min[10]，收集上清液测定发酵液效价.

1.2.4 单因素实验

以初始pH、接种量、玉米浆添加量、发酵温度、进行单次单因素实验，每个水平重复3次取其平均值，分析各单因素对Nisin发酵效价的影响.

1.2.5 响应面法优化Nisin的发酵参数

根据单因素实验结果，通过Box-Behnken模型以玉米浆添加量(A)、接种量(B)、初始pH(C)为自变量，以Nisin的效价为响应值设计响应面实验，拟合自变量与响应值之间的关系.每个实验重复3次，取平均值，实验因素及水平如表1所示.

表1 实验水平及编码

1.2.6 测定方法

效价测定方法:琼脂扩散法[11]；OD600值的测定：分光光度法测定；pH值的测定：pB-10精密pH计测定.

2 结果与讨论

2.1 嗜热乳链球菌6032发酵曲线

由图1可知，菌体生长经历停滞期、对数期、稳定期，菌体在生长18 h后达到最大.嗜热乳链球菌发酵生产Nisin的过程中，Nisin的产生与生物量的合成几乎同步进行.当细胞生长进入稳定期后，Nisin的合成也随之停止，这是因为在发酵过程中产生大量的乳酸，过低的pH影响乳链球菌菌体的生长，从而抑制了Nisin的合成.进入稳定期的效价维持一段时间后开始有下降的趋势，因此,确定合适的发酵时间十分重要,可选择最佳发酵时间为20 h.

图1 嗜热乳链球菌6032生长 曲线、pH、效价变化曲线

2.2 不同单因素对Nisin效价的影响

2.2.1 接种量对Nisin效价的影响

接种量的大小影响细胞的生长和代谢产物的合成，接种量小，使发酵菌株的延迟期增长，不利于产物的产生和积累，发酵周期长；接种量过高反而使菌体生长过快，积累过多的代谢产物，抑制后期菌体的生长.为了确定最适的接种量，设计不同接种量发酵实验，实验结果如图2所示.

图2 不同接种量对Nisin效价的影响

由图2可知，当接种量较小时，Nisin的效价很低，可能是嗜热乳酸链球菌没能达到菌体的最大密度，从而影响Nisin的产生和累积，当接种量过大时，细胞之间竞争性的消耗底物，影响Nisin的合成.当发酵培养基的接种量为5%时,Nisin的效价达到最大，为902.48 IU/mL.

2.2.2 不同初始pH对Nisin效价的影响

发酵环境的pH对微生物生长和产物合成具有明显的影响，pH的改变影响细胞膜的通透性，影响细胞代谢活动中的酶的活性，从而影响产物的产生和积累.为了确定最适的初始pH，设计不同pH的发酵实验，实验结果如图3所示.

图3 不同初始pH对Nisin效价的影响

由图3可知，发酵培养基的不同初始pH对Nisin效价的影响比较明显，pH过高或者过低都影响乳链球菌的生长和Nisin的累积，发酵培养基的初始pH为7时，Nisin的效价达到最高，为875.79 IU/mL.嗜热乳酸链球菌为细菌，其最适生长pH为6.5～7.0，而的Nisin合成和细胞的生长同步进行，因此在pH为7时，Nisin的效价最大.

2.2.3 不同玉米浆添加量对Nisin效价的影响

玉米浆富含维生素、生物素、嘌呤、嘧啶等微量有机质[12]对菌体的生长会有促进作用，从而提高了乳链菌肽的效价.选玉米浆作为Nisin发酵培养基主要成分之一, 对玉米浆的最佳添加量进行考察.

图4 玉米浆浓度对Nisin效价的影响

由图4可知，随着玉米浆添加量的增加，Nisin的效价先是增大后减少，当玉米浆添加量为25%时，Nisin的效价达到最大为1 357.46 IU/mL.可能是因为玉米浆的质量浓度提高时,体系营养成分增加,有利于菌体生长繁殖,使得发酵液中Nisin的效价增加.但加入的营养过多,嗜热如链球菌生长过快，加速了细菌的衰老，反而抑制了菌体的正常生长从而使Nisin的活性下降.因此选取玉米浆的最佳添加量为25%.

2.2.4 不同培养温度对Nisin效价的影响

温度影响细菌细胞的生长和代谢产物的积累，是发酵过程中的重要影响因素.细菌的最适培养温度不一定是最适发酵温度，为了研究最适发酵温度，设计不同温度梯度，考察不同温度对Nisin效价的影响.

图5 培养温度对Nisin效价的影响

由图5可知，培养温度过高过低时，Nisin的效价比较低，可能是因为温度过低时不适于细胞的生长，从而影响代谢产物的积累.培养温度过高时，细胞生长繁殖加快，酶的活性加快，使细胞衰老提前，发酵周期缩短，也不利于产物的积累.培养温度在30 ℃～34 ℃范围内，对Nisin的效价没有影响，响应面设计不考虑温度的影响，选择30 ℃作为最佳的培养温度.

2.3 响应面模型的建立以及验证实验

在单因素实验的基础上进行响应面分析，确定Nisin的最佳发酵参数.通过Box-Behnken模型[13,14]分析发酵初始pH、接种量、玉米浆添加量对Nisin效价的影响.实验结果如表2所示.

表2 Nisin发酵条件的响应面实验设计及结果

利用Design Expert7.0软件对表 2 数据进行多元回归拟合，二次多项式回归模型方程Y=1 528.22+193.38A-32.46B-100.42C-86.37AB-49.55AC+167.56BC-696.46A2-216.39B2-190.13C2.

对上述回归模型进行方差分析如表3所示.结果表明：模型是F值30.24，P<0.000 1，说明该模型是极显著的，该模型与实际实验拟合较好，可以用于Nisin发酵生产的理论预测.回归模型的RAdj=0.942 7，能够解释97.49% 的变化，拟合度良好，实验误差小.方程一次项的影响中A和C的P<0.01，差异极显著，B的P>0.05，差异不显著；二次项的影响中A2、B2、C2的P<0.01，差异极显著；AB、AC的交互作用P>0.05，交互差异不显著，BC的交互作用P<0.01差异极显著.

通过回归系数绝对值大小分析各个因素的改变对嗜热乳链球菌6032 发酵产Nisin影响程度.3个因素对该菌代谢产Nisin的影响大小依次为：玉米浆浓度添加量>发酵pH>接种量.

表3 回归方程系数显著性分析表

注：P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著.

利用Design Expert软件对表2数据进行二次多元回归拟合，得到的二次回归方程的响应面和等高线.

(a)A和B的交互效应

(b)A和C的交互效应

(c)B与C的交互效应图6 各因素交互效应对Nisin效价影响 的响应曲面及等高线图

经Design Expert软件处理，得到的响应面曲面及等高线图如图5所示，响应面的形状可反应出单因素对Nisin效价的影响.由图5(a)可以看出，两个因素的交互不显著，由等高线图可知，玉米浆添加量对Nisin的影响比初始pH影响显著，因为沿玉米浆添加量轴向等高线相对密集.由图5(b)可见，两个因素的交互不显著.由图5(c)可以看出，两个交互项显著，接种量不变，随着pH变小，Nisin的效价增大.当接种量4%～5%，pH5～6时，Nisin的效价达到最大，可能是因为菌体生长的最适pH值不一定是Nisin合成的最佳pH值[15].大多数认为pH应在5.8～6.0之间生产Nisin是合适的，这通常低于最佳生长pH.

通过回归模型，采用Design-Expert 7.0软件优化乳链球菌发酵生产Nisin发酵参数，当初始pH6.60，接种量4.79%，玉米浆浓度25.61%，Nisin的效价可达到1 581.01 IU/mL.考虑到实际操作的便利，将发酵条件修正为初始pH6.60、接种量4.80%、玉米浆添加量25.60%.采用修正后的条件参数进行3次平行验证实验，获得的Nisin效价为1 602.77 IU/mL，实验相对误差小.发酵条件优化前，Nisin的效价为1 357.41 IU/mL,优化后Nisin的效价达到了1 602.77 IU/mL，Nisin的效价提高了18.07%.

3 结论

(1)嗜热乳链球菌发酵生产Nisin，单因素实验结果表明，在接种量为5.0%、初始pH为7.0、玉米浆的添加量为25.0%、培养温度30 ℃条件下，Nisin的效价为1 357.46 IU/mL.

(2)利用Design-Expert7.0软件设计响应面对Nisin发酵条件进行优化，建立了Nisin效价与初始pH、接种量、玉米浆添加量3个因素的二次多项式回归模型，回归分析表明，玉米浆添加量(A)、初始pH(C)对响应值均有极显著影响，且与响应值之间不是简单的线性关系，经验证实验证明该模型合理可靠.

(3)玉米浆浓度对影响Nisin效价影响最大，而接种量影响最小，初始pH与玉米浆添加量交互效应为显著.

(4)响应面优化得到的最佳发酵条件为初始pH6.60、接种量4.80%、玉米浆添加量25.60%.在此条件下效价为1 602.77±6.38 IU/mL，较优化前提高了18.07%.

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