PB法筛选保加利亚乳杆菌增殖培养基的研究

陈 合， 陈世伟， 李串娜， 舒国伟

(陕西科技大学 生命科学与工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

近年来，酸乳制品因其具有保健、长寿、美容以及医药应用的效果而倍受消费者青睐，市场前景十分广阔[1,2].保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus) 是用于酸乳发酵的主要菌种之一，其通过发酵鲜奶产酸、产胞外多糖以及风味物质，赋予酸奶独特的风味、良好的质地和细腻的口感.同时，其具有调节人体胃肠道微生态平衡、促进消化吸收、增强免疫功能、抗癌抗肿瘤等重要的生理保健功能，因而受到更多人的关注[3].

在酸乳生产中，开发高活性、低成本酸奶直投式发酵剂备受国内外学者关注，而该工作首先必须获得能够使乳酸菌快速生长的增菌培养基[4].乳酸菌增菌培养基的研究国内外具有不同的方法.如程艳宇[3]等人，通过优化MRS培养基中Mg，Mn和Fe 3种微量元素的配比，实现了保加利亚乳杆菌的增殖.刘海燕[5]、吕加平[6]等人使用番茄汁、胡萝卜汁、啤酒等物质对植物乳杆菌等乳酸菌进行了增殖研究，并取得了一定成果.安莉[7]等人以17种氨基酸与牛乳的复合物为主要材料，研究了氨基酸对保加利亚乳杆菌生长的影响，证明丝氨酸、赖氨酸、亮氨酸与牛乳复合时对保加利亚乳杆菌促生长作用明显.Claire L.V.[8]、周景欣[9]等人经过体外试验、临床研究发现，低聚异麦芽糖、低聚半乳糖、低聚果糖、低聚木糖、大豆低聚糖等对人体肠内乳酸杆菌均有明显的增殖作用.另有研究者[10,11]利用保加利亚乳杆菌发酵不同蔬菜来研究蔬菜对其增殖的影响，取得了一定的成果.

本课题组前期从牛乳发酵剂中筛选获得了能显著降低羊乳膻味和改善羊乳质地的发酵菌株，并对其凝固羊乳发酵条件进行了优化[12]，通过添加嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌等适宜菌株研究了羊乳发酵的条件[13].本文采用保加利亚乳杆菌(LB)为试验菌株，以基础培养基为基础，通过PB实验设计方法，对7种碳源/益生元和8种氨基酸进行了筛选，以期获得影响LB增菌的碳源/益生元和氨基酸，为进一步优化保加利亚乳杆菌增菌培养基和制备直投式酸羊奶冻干发酵剂提供技术支撑.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种及培养基

保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus，LB)，由本实验室前期分离筛选，适宜用于羊奶发酵.

MRS培养基：青岛高科园海博生物技术有限公司，液体培养基用于LB的活化，琼脂培养基用于其计数.

LB发酵基础培养基：葡萄糖5.43 g，蛋白胨0.98 g，磷酸氢二钾0.59 g，蒸馏水100 mL，pH值6.4～6.6.118 ℃灭菌15 min.用于LB的基础培养.

1.1.2 主要试剂及仪器

实验中各种糖类、氨基酸以及上述培养基中所用试剂均为生化试剂级.DH5000AB型电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；SW-CJ-1F 无菌操作台：苏州净化设备有限公司；DH5000AB 电手提式蒸汽压力灭菌器：江阴滨江医疗器械厂；722型光栅分光光度计：上海第三分析仪器厂；PB-10酸度计：赛多利斯(北京)科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌种活化及培养

MRS培养基经118 ℃灭菌15 min，放于冰箱备用.取保加利亚乳杆菌(LB)的冻干菌粉，在无菌条件下，以2%的接种量接种于MRS培养基中，37 ℃下恒温培养24 h.镜检确定无杂菌，再重复转接3次至活力稳定，即可达到活化目的.

1.2.2 保加利亚乳杆菌培养基优化

本实验采用PB设计进行分类筛选，以LB发酵基础培养基为培养基，优化碳源(乳糖、低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、低聚异麦芽糖、水苏糖及菊糖7种)、氨基酸(羟脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸、精氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及谷氨酸8种).以上实验接种量均为3%，35 ℃培养20 h后，测定其pH、OD值及活菌数.每组做3个平行，以活菌数为响应值，确定最优的碳源及氨基酸.

1.2.3 菌体浓度测定

(1)活菌计数法：采用固体MRS培养基，梯度稀释平板计数法分别对LB进行计数.

(2)分光光度法：取增菌培养液，以未接种的空白培养基为对照，采用可见光分光光度计，在波长600 nm下比色而得.

1.2.4 培养液pH值的测定

采用PB-10酸度计，室温下直接测定发酵液pH值，每份3个平行.

1.2.5 碳源/益生元影响因子的筛选

选取N=12的PB设计，以葡萄糖(X1)，乳糖(X2)，低聚木糖(X3)，低聚果糖(X4)，低聚半乳糖(X5)，低聚异麦芽糖(X6)，水苏糖(X7)，菊糖(X8)8个因素为考察对象，并以活菌数(Y)为响应值，各因素分别取高(+)、低(-)两个水平，低水平设置为原始的培养条件，高水平是低水平的2倍，12次试验中，菌体均在35 ℃下培养20 h后，测定其pH、OD及活菌数，每组设3个平行.各个因素的编码水平见表1所示.

表1 碳源/益生元PB因素水平表

1.2.6 氨基酸影响因子的筛选

菌体的生长除了碳源外，还需要氨基酸、维生素等物质，它们能对菌体的生长起到一定的促进作用.采用9因素两水平、N=12的实验设计，对羟脯氨酸(X1)、精氨酸(X2)、亮氨酸(X3)、丝氨酸(X4)、天冬氨酸(X5)、酪氨酸(X6)、谷氨酸(X8)、苯丙氨酸(X9)等进行研究.其中(X7)是虚拟项，以减少误差.活菌数(Y)为响应值，筛选出影响较大的因素.35 ℃下培养20 h后，测定其活菌数及pH，每组设3个平行.各个因素的编码水平见表2所示.

表2 氨基酸类PB因素水平表

2 结果与讨论

2.1 碳源/益生元影响因子筛选结果分析

试验设计及结果见表3所示.OD和pH作为参考值，活菌数为响应值.

表3 碳源/益生元PB试验设计及结果

使用SAS软件对试验结果进行分析，如表4所示.结果显示，各个因素对LB生长的影响强弱为：X1>X8>X4>X6>X2>X5>X7>X3.其中X1(p=0.033)是影响LB生长的显著因素，X4(p=0.091)、X8(p=0.061)均为重要因素.X1、X4、X8对LB生长影响均呈正效应(如图1所示).

上述结果中菊糖、低聚果糖对LB的增菌影响与周景欣[14]、吕利军[15]等人的研究结果相似，均对乳杆菌具有增菌作用；葡萄糖、乳糖的增菌作用与史媛英[16]的研究结果有差异，本实验中葡萄糖的影响更加显著，乳糖的作用较小且呈负效应(T=-1.265)，这种差异可能是菌种不同所导致.

表4 碳源/益生元PB设计试验方差分析

图1 碳源/益生元95%的CI 区间图

2.2 氨基酸影响因子筛选结果分析

试验设计和结果见表5所示，分析时以活菌数为响应值.

表5 氨基酸类PB试验设计及结果

根据SAS软件分析得到图2，由图2可知，剔除X7虚拟项后的八个因素，其中前三个因素即谷氨酸(X8)、羟脯氨酸(X1)和酪氨酸(X6)，条带较长，即对LB生长的影响较大.且X1、X6 对响应值Y呈正效应，而影响最大的X8则呈负效应(T=-1.005),如图3所示.

上述结果与安莉[7]等人的研究结果不同，在本实验中丝氨酸、赖氨酸的影响相对于谷氨酸、羟脯氨酸和酪氨酸较小，且亮氨酸呈负效应.

图2 PB试验设计氨基酸类主因子筛选主次图

图3 氨基酸类95%的CI区间图

3 结论

采用PB实验设计，从7种碳源/益生元和8种氨基酸中分别筛选出显著影响保加利亚乳杆菌增殖的因子.结果表明，葡萄糖、低聚果糖、菊糖、酪氨酸和羟脯氨酸等有利于保加利亚乳杆菌的生长，概率水平>90%，且对菌体的累积呈正效应，其中影响最显著的碳源为葡萄糖(p=0.033)，概率水平>95%；谷氨酸的添加对保加利亚乳杆菌的生长有显著的抑制作用，在直投式酸羊乳冻干发酵剂制备中其添加量受到限制.

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