清热益气通络方治疗糖尿病肾病大鼠蛋白尿的实验研究

朱海慧，叶学锋，谢春光

(成都中医药大学：1.临床医学院；2.附属医院肾内科；3.附属医院内分泌科，四川成都 610072)

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN) 是糖尿病常见的并发症，其临床特点为进行性加重的蛋白尿和肾小球硬化，并逐渐进展直至终末期肾病。而蛋白尿是DN治疗的难点，也是加重肾功能损害的危险因素之一。足细胞损伤在DN中的作用是目前DN研究的热点，被认为是DN蛋白尿的发生的关键。研究认为，足细胞损伤时足细胞特异性标志物减少或丧失，发生上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，是DN蛋白尿发生的主要原因，也是足细胞出现脱落和凋亡前的一个可逆过程[1]。有文献报道，DN足细胞损伤时足细胞表面特异性蛋白如nephrin 、podocin、podocalyxin、CD2-AP、Z0-1、desmin等表达异常[2]，但尚少见中医药在podocalyxin及desmin等方面的研究的报道。清热益气通络方药前期实验研究显示，其能拮抗足细胞podocin、nephrin蛋白的表达异常、降低DN大鼠蛋白尿[3]。本实验通过单侧肾切除链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病模肾病模型，探讨清热益气通络方对DN大鼠蛋白尿的治疗作用，并从DN足细胞转分化方面探讨其作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及模型建立健康雄性SD大鼠共60只，体质量(200±20)g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供(合格证：SCXK(陕)2007-001)。设立正常对照组10只，其余50只参照文献[4]采用单侧肾切除STZ腹腔注射法建立大鼠DN模型：适应性喂养1周，第2周100 g/L水合氯醛溶液(3 mL/kg)ip麻醉，背部切口行左肾切除术；第4周大鼠禁食16 h，正常对照组大鼠等量枸橼酸钠缓冲液ip，其余大鼠10 mg/L的链脲佐菌素柠檬酸钠溶液(55 mg/kg)ip，3 d后尾静脉穿刺采血测定血糖值，监测尿糖、尿量及24 h UPro。以连续2次随机血糖>16.7 mmol/L、尿糖强阳性、尿量>原尿量150%、24 h UPro >30 mg者为DN成模标准[5]。

1.2分组及给药第6周将造模成功的37只大鼠随机分为：模型组13只、中药组12只、厄贝沙坦组12只。对照组和模型组给予等容积纯净水ig、治疗组分别给予厄贝沙坦0.05 g/(kg·d)ig，中药浓缩液36.67 g/(kg·d)ig，共治疗12周。

1.3主要药物及试剂链脲佐菌素(streptozotocin, STZ，Sigma公司，批号20120601)；厄贝沙坦(杭州赛诺菲安万特民生制药有限公司，批号2A245)；中药饮片(葛根、黄柏、牛蒡子、黄芩、黄芪等购于西安怡康大药房，煎煮、水浴蒸发至每毫升含生药材3 g)；小鼠抗大鼠podocalyxin单抗、兔抗鼠WT1多抗(Abcam公司，购于博研生物科技有限公司，批号20121001)；兔抗鼠desmin多抗、羊抗兔IgG/FITC、山羊抗小鼠IgG/Cy3(北京博奥森生物技术有限公司，批号20121002)；肌酐、考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒(南京建成生物工程有限公司，批号20101025)；大鼠umAlb ELISA试剂盒(苏州卡尔文生物科技有限公司,批号20121002B)。

1.4检测指标及方法

1.4.1BW/KW、24 h UPro、24 h umAlb、CCr的检测 第18周实验结束，代谢笼收集大鼠24 h尿液，股动脉采血离心取血清。ELISA试剂盒检测24 h umAlb，考马斯亮兰法检测24 h UPro，苦味酸法测血、尿Cr，计算CCr。大鼠称重，右肾去包膜称重，计算BW/KW。

1.4.2podocalyxin、desmin的检测 免疫荧光双标记podocalyxin、desmin，在荧光显微镜下通过转换滤色镜采集同一视野两种荧光图像，并用Image-Pro Plus软件叠加合成图像，分析两种抗原单位面积肾小球平均吸光度(单位面积肾小球平均积分吸光度=阳性区积分吸光度/肾小球面积)。

1.4.3足细胞计数及密度 免疫荧光标记WT1蛋白，每切片选30个肾小球，计数每个肾小球内WT1阳性细胞个数，计算足细胞密度(WT1阳性细胞数/肾小球面积)，取其平均值。

1.4.4病理观察 部分肾组织经Carnoy固定液固定，PAS染色，光镜观察；取约1 mm3肾皮质25 mL/L戊二醛固定，醋酸铀、柠檬酸铅染色，透射电镜观察超微结构。

2 结 果

2.1一般情况对照组大鼠活泼、反应敏捷，皮毛洁净,摄食及饮水正常；其余3组大鼠活动明显减弱，皮毛无光泽，尾部污垢，明显多饮、多食、多尿，消瘦，实验过程出现不同程度其他糖尿病并发症及死亡(模型组、中药组各死亡3只，厄贝沙坦组死亡4只，死亡原因为中风、肾脓肿、腹泻及严重便秘并发症)。

2.2各组KW/BW、24hUPro、24humALb、Ccr的比较表1显示，模型组大鼠KW/BW、24 h umALb、24 h Upro、Ccr升高，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；中药及厄贝沙坦均能降低KW/BW、24 h UPro、24 h umALb(P<0.01，P<0.05)，厄贝沙坦还可降低过高的Ccr(P<0.05)；中药降低24 h UPro作用显著优于厄贝沙坦组(P<0.05)。

表1各组KW/BW、24hUPro、umALb、Ccr的比较

Tab.1 Comparison of KW/BW, 24 h UPro, umALb and Ccr in all the groups

组 别例数 KW/BW(mg/g) Ccr[mL/(min·kg)] 24h umALb(mg) 24h UPro(mg)对照组103.42±0.282.91(2.51～2.93)0.22(0.19～0.28)22.11(17.64～25.73)模型组108.85±0.46*6.31(5.34～7.31)*4.86(3.46～5.42)*175.96(125.86～195.22)*厄贝沙坦组88.38±0.33*4.64(4.54～6.12)#3.47(2.69～3.81)#125.18(112.50～152.31)#中药组98.33±0.34*5.64(4.16～6.07)3.20(2.23～3.88)▲107.77(92.51～122.92)△▲F(Z) 521.19 22.42 24.63 29.53P 0.000 0.000 0.000 0.000

与对照组比，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.05,△P<0.01；与厄贝沙坦组比，▲P<0.05。

2.3各组足细胞计数及密度的比较表2显示，与对照组相比，DN模型组大鼠肾小球足细胞绝对计数无明显降低(P>0.05)，但足细胞密度显著降低(P<0.01)；与模型组相比，中药组及厄贝沙坦组足细胞密度显著升高(P<0.01)。

表2肾小球足细胞计数及足细胞密度

Tab.2 Comparison of podocyte number and density in glomerulus in all the groups

组 别例数足细胞绝对计数(个)足细胞密度(个/μm2)对照组1037.63±2.045.48±0.29E-03模型组1036.50±1.954.03±0.30E-03*厄贝沙坦组836.92±2.154.55±0.20E-03△中药组936.99±1.644.48±0.31E-03△ F0.57 74.337 P0.639 0.000

与对照组比，*P<0.01；与模型组相比，△P<0.01。

2.4各组podocalyxin、desmin表达及吸光度的比较比较同一视野采集的肾小球podocalyxin/desmin免疫荧光双标记图像(图1)，结果发现，podocalyxin蛋白在对照组大鼠肾小球血管襻大量均匀表达(红色)；模型组、中药组及厄贝沙坦组DN大鼠肾小球血管襻podocalyxin蛋白表达量少，个别肾小球甚至完全无表达。对照组大鼠肾小球desmin蛋白(亮绿色)主要表达在系膜区，与对照组相比DN大鼠肾小球内desmi蛋白表达显著增加，在毛细血管壁沿基底膜出现了较强的阳性表达，呈线性分布，在部分肾小球毛细血管袢两种蛋白表达有重叠(黄绿色或橙色)。与对照组组相比，模型组大鼠肾小球podocalyxin蛋白单位面积肾小球吸光度显著降低(P<0.01)，desmin蛋白吸光度显著增高(P<0.01)；中药及厄贝沙坦均能显著上调DN大鼠肾小球podocalyxin表达及下调desmin表达，与模型组比有统计学差异(P<0.05或P<0.01)；中药上调podocalyxin表达的作用优于厄贝沙坦(P<0.05，表3)。

图1podocalyxin/desmin共表达

Fig.1 Colocalization of podocalyxin and desmin in the glomerulus of different groups of rats (×400)

A：对照组；B：模型组；C：厄贝沙坦组；D：中药组。

2.5肾小球的光镜及电镜病理观察光镜下模型组大鼠肾小球体积增大，血管袢扩张，部分肾小球系膜区轻度增宽，可见肾小管上皮细胞水肿及小管扩张现象；间质无明显水肿。中药组及厄贝沙坦组病变与模型组类似但程度稍轻(图2)。电镜下对照组大鼠肾小球毛细血管襻管腔充盈，基底膜厚度基本均匀，足细胞足突结构清晰，排列整齐，足突间隙基本正常。模型组大鼠肾小球毛细血管襻管腔增大，病变小球血管襻基底膜节段性增厚，足细胞足突排列紊乱、增宽、节段性融合，严重者融合广泛，未见有明显足细胞缺失。中药组及厄贝沙坦组电镜下病变程度及范围相对较轻(图3)。

表3肾小球podocalyxin、desmin单位面积肾小球平均吸光度的比较

Tab.3 Comparison of podocalyxin, desmin integral optical density per unit area in glomerulus (IA/glomerular area)

组 别例数podocalyxindesmin对照组100.2454±0.02110.1071±0.0167模型组100.0978±0.0167*0.2185±0.0234*厄贝沙坦组90.1272±0.0163△0.1907±0.0174*中药组80.1459±0.0152△0.1944±0.0152# F 130.25 63.46 P 0.000 0.000

与对照组比，*P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，△P<0.01；与厄贝沙坦组比，▲P<0.05。

3 讨 论

根据文献报道，应用单侧肾切除STZ糖尿病大鼠可以在较短时间内出现糖尿病的肾脏病理改变，而保留双肾的STZ糖尿病大鼠往往在9～12个月才出现早期肾脏改变[3]。因此，我们选用单侧肾切除STZ腹腔注射建立DN模型，与前期实验[2]采用STZ诱导的DN模型比较，蛋白尿升高明显，肾脏病理改变更为典型。

中医无糖尿病肾病病名，历代医家在消渴病、水肿、尿浊、关格等相关病证中，从不同层面对进展后DN进行了丰富的辩证论治。明代戴原礼《证治要诀》则指出：“三消久而小便不臭，反作甜气，在溺中滚涌，更有浮溺面如猪脂，此精不禁，真元竭也。”这种尿液表现可见于糖尿病肾病尿中有较大量蛋白者。多数中医学者都认同消渴病肾病的基本病机是气阴两伤为本、燥热瘀血为标，气虚血瘀，贯穿始终，致肾失封藏，脾失统摄，精微下流形成蛋白尿。根据历代医家对糖尿病肾病的认识，结合相关文献研究[6-7]及临床实践，叶学锋教授认为，燥热内盛是早期DN发生的主要病机，血瘀贯穿于DN发生发展的始终，清热解毒、活血通络可能是防治DN的有效方法一。清热益气通络方选用葛根为君药清热生津，升举阳气；黄芩清热燥湿，苦寒坚阴，牛蒡子苦寒清热，臣辅君药坚阴；山茱萸补肝肾之阴、黄芪补肺脾之气；川芎、水蛭活血通络。诸药协同起到清热活血、固本通络的作用，临床应用于早中期DN疗效显著。方中主要药物葛根、黄芪等现代药理研究证实对糖尿病肾病具有治疗和保护作用。文献报道，葛根素能提高糖尿病肾病CAT、SOD、GSH-Px，降低肾组织MDA含量，有效抑制糖尿病大鼠肾脏氧化应激反应,改善肾功能[8]。 黄芪主要含有黄芪多糖及黄芪皂甙等， 文献报道[9]其主要通过降糖、调脂、调节内皮素与一氧化氮平衡、改善血小板功能、抗过氧化、抗蛋白非酶糖化等作用治疗糖尿病肾病。本实验结束时观察到模型组大鼠肾脏肥大，KW/BW、24 h umALb、24 h UPro、Ccr升高；光镜病理显示糖尿病大鼠肾小球体积显著增大，部分小球出现轻度系膜区增宽；电镜下肾小球毛细血管腔扩张，病变肾小球基底膜呈节段性增厚，病变足细胞足突变宽、融合。以上提示本实验糖尿病肾病模型复制成功。清热益气通络方及厄贝沙坦均能显著降低以上指标，且清热益气通络方降低24 h UPro的作用显著优于厄贝沙坦。

图2光镜下各组肾组织的病理变化

Fig.2 Kidney pathology of different groups of rats (PAS staining, ×400)

A：对照组；B：模型组；C：厄贝沙坦组；D：中药组。

图3各组肾小球的超微结构

Fig.3 Glomerular ultramicrostructure observation of different groups of rats (×30 000)

A：对照组；B：模型组；C：厄贝沙坦组；D：中药组。

足细胞上皮-间充质转化是指在某些刺激物作用下，足细胞失去上皮细胞样表型标志物如nephrin、ZO-1、P-cadherin等，而表达上调间充质细胞样表型标志物如FSP-1、desmin、胶原Ⅰ(collagenⅠ)等，显现转分化特征，在蛋白尿发生发展过程中发挥重要的作用[10]。若早期去除损伤因素，足细胞能恢复至正常的上皮细胞表型,而并不发展至凋亡和脱落。因此，采取合理措施在DN早期能逆转足细胞转分化即可减轻或消除蛋白尿。本实验借助足细胞特定标志物WT1染色计数足细胞数，选用podocalyxin作为正常足细胞的标志物，desmin作为转分化后细胞标志物，免疫荧光双标记染色观察DN大鼠足细胞表型变化和清热益气通络方对它们的影响。WT1[11]是一种锌指样转录因子，肾脏形成后仅定位于成熟足细胞，在肾脏内皮细胞及系膜细胞不表达，是足细胞特异性标志之一，常用来标记计数足细胞。podocalyxin由肾小球内皮细胞和足细胞合成，是肾小球主要带负电荷的蛋白分子，组成GBM电荷屏障，在足细胞成熟过程中固定于肾小球足细胞顶膜，因含有大量负电荷而具备抗粘附的特性被认为是保持滤过膜开放的重要分子[12]。desmin属于细胞骨架的中间丝蛋白，正常情况下主要在系膜细胞表达，当足细胞因各种原因发生损伤时,可大量表达结蛋白。本实验结果显示，DN大鼠肾小球WT1阳性细胞绝对计数与对照组相比无明显减少，但密度显著低于对照组，结合电镜对肾小球超微结构的观察结果，提示DN糖尿病肾病大鼠在本实验时段里无明显足细胞的脱失。模型组大鼠肾小球足细胞标志物podocalyxin表达显著降低，desmin表达升高，podocalyxin与desmin表达量呈反向关系，且两种蛋白在肾小球毛细血管襻有共表达现象(黄绿色)；清热益气通络中药及厄贝沙坦均能够拮抗糖尿病肾病大鼠肾组织podocalyxin蛋白表达降低和结蛋白desmin表达升高的异常，且清热益气通络方上调podocalyxin的作用优于厄贝沙坦。

本研究表明，清热益气通络中药虽无厄贝沙坦的显著降压、降低肾小球高滤过、高压的作用，但在拮抗足细胞损伤后出现的足细胞表型异常方面具有一定优势。通过拮抗 DN大鼠足细胞表型podocalyxin表达降低和desmin表达升高的异常，一定程度上抑制足细胞上皮-间充质转分化，可能是清热益气通络方药治疗糖尿病肾病蛋白尿的部分作用机制。

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