重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建、表达及其对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

尉春艳，张 熙，孙学军，彭慧霞，史玉霞，王桂贤

(西安交通大学医学院：1.第二附属医院妇产科，陕西西安 710004； 2.第二附属医院神经外科，陕西西安 710004；3.第一附属医院普外科，陕西西安 710061)

卵巢癌是女性生殖系统恶性肿瘤之一，早期症状不明显，很多患者诊断时已至晚期，而且极易复发转移、死亡率很高。卵巢癌的发生发展及侵袭机制不清。近年的研究发现上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)与包括卵巢癌在内的多种恶性肿瘤的转移密切相关。在EMT 过程中细胞间的连接丢失，细胞活动能力增加，并拥有间质细胞的特征，是恶性肿瘤细胞获得转移侵袭能力过程中的重要事件[1]。Twist基因编码的蛋白在EMT过程中具有重要作用。本研究通过构建含有Twist基因的重组质粒pEGFP-N1-Twist，为进一步研究上皮性卵巢癌的发生、发展及浸润转移奠定基础。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂Twist cDNA序列合成(609 bp)、Twist上下游引物(上海生工)；EcoRⅠ、BamHⅠ、T4 DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒(TaKaRa)；pEGFP-N1载体(美国Clontech公司)；LipofectamineTM2000(Invitrogen)；SKOV3细胞系为西安交通大学医学院中心实验室保存；Trizol(Invitrogen);Real-time PCR试剂盒(北京全式金公司)；鼠抗人Twist(Santa)、鼠抗人β-actin(Sigma)。

1.2Twist过表达载体即重组质粒pEGFP-N1-Twist的构建在NCBI数据库中查找出human Twist cDNA序列，并生物合成。按以下体系配制退火反应体系：正义寡核苷酸(100 μmol/L)5 μL，反义寡核苷酸(100 μmol/L)5 μL，NaCl 100 mmol/L，Tris-Cl pH 7.4 50 mmol/L，总反应体系50 μL。按以下程序：90 ℃ 4 min，70 ℃ 10 min，55 ℃ 10 min，40 ℃ 10 min，25 ℃ 10 min退火。按如下反应条件双酶切载体：10×缓冲液2 μL，pLentilox 3.7 1 μL，EcoRⅠ 1 μL，BamHⅠ 1 μL，ddH2O 15 μL，37 ℃酶切3 h。酶切产物于10 g/L琼脂糖凝胶上电泳分离后用胶回收试剂盒纯化。将纯化的质粒浓度调整为0.5 μg/μL，按照以下体系配制连接反应体系：T4 DNA连接酶 1 μL，线性化载体1 μL，退火寡核苷酸3 μL，10×连接酶Buffer 1 μL，加水补足10 μL，16 ℃酶连接16 h。在氨苄抗性的固态培养基平板上37 ℃培养转化后的DH5α感受态细胞，挑取其多个菌落至氨苄抗性的培养基中培养后进行测序鉴定。

1.3Twist转染SKOV3细胞株按Invitrogen公司的LipofectamineTM2000试剂盒说明书，将pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系：SKOV3转染前24 h接种于6孔培养板，纯化的重组质粒4 μg，12 μL LipofectamineTM2000，稀释于250 μL Opti-MEM I Reduced Serum Medium中混匀，室温孵育20 min，8 h 换液，转染48 h后免疫荧光检测转染效率，采用空载体作为对照组。

1.4Real-timePCR用Trizol法提取总RNA。根据Twist序列设计合成上游及下游引物，Twist S：CGGGAGTCCGCAGTCTTA，Twist A：ACGCCCTGTTTCTTTGA，PCR反应体系(25 μL)：SuperMix 12.5 μL，S引物0.5 μL，A引物0.5 μL，Passive Reference Dye 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9 μL；程序设置如下：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s 40循环，72 ℃ 20 s ，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，60～95 ℃ 20 min，95 ℃ 15 s。Realplex软件导出数据并分析。

1.5Westernblot细胞裂解后收集蛋白样品，根据碧云天BCA试剂盒说明书中步骤测定蛋白浓度。取45 μL蛋白样品以12%分离胶，5%浓缩胶电泳后转至PVDF膜上、丽春红染液中染色，洗膜后5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)，室温孵育1 h，TBST洗膜3次后显影及数据分析。

1.6克隆形成实验取对数生长期细胞，2.5 g/L胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，活细胞计数，调整细胞密度至1×103细胞/mL。用蒸馏水分别制备出12 g/L和7 g/L两个质量浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持40 ℃不凝。按1∶1比例使12 g/L的琼脂糖和2×DMEM/F12培养液(含有2×抗生素和200 mL/L FBS)混匀后，取3 mL混合液注入直径6 cm平皿中，冷却凝固置CO2温箱中备用。按1∶1比例让7 g/L的琼脂糖和2×DMEM培养液在无菌试管中相混以后，再向管中加入细胞悬液，充分混匀，注入铺有12 g/L琼脂糖底层平皿中，逐渐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37 ℃ CO2温箱中培养10～14 d。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。按公式计算克隆形成率。克隆形成率(%)=克隆数/接种数×100。

1.7统计学处理采用SPSS 12.0统计软件进行两组间独立样本t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1构建重组质粒pEGFP-N1-Twist由上海生工生物合成Twist cDNA序列，用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切，经纯化、连接后，转化DH5α感受态细胞，经测序鉴定，cDNA序列总长度与预期大小一致，与NCBI数据库中的Twist cDNA序列同源，证明Twist cDNA序列已经成功构建到pEGFP-N1载体上。

2.2免疫荧光检测pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞株将带有荧光标记的重组质粒pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞系，转染48 h后，用免疫荧光检测转染效率。干预组细胞可稳定表达绿色荧光蛋白，GFP表达量高，转染效率80%以上；对照组未检测到明显的荧光蛋白表达(图1)。转染Twist 36、48、54 h后，Twist免疫荧光均呈阳性，转染结果可行(图2)。

2.3重组质粒中TwistmRNA和Twist蛋白的表达以GAPDH作为内参基因，溶解曲线可见两个主峰，说明设计的引物特异性良好。干预组的mRNA水平明显高于空白组和空载体组，差异具有统计学意义(P<0.05)；空白组和空载体组差异无统计学意义(P>0.05，图3B)。干预组Twist蛋白的表达高于空白组和空质粒组；空白组和空载体组无明显差别(图3A)。

图1pEGFP-N1-Twist在SKOV3细胞株中的转染

Fig.1 Transfection of pEGFP-N1-Twist into SKOV3 cells

A：无明显GFP表达；B：GFP表达量高。

图2pEGFP-N1-Twist转染入SKOV3细胞后不同转染时间的转染效率

Fig.2 Transfection of pEGFP-N1-Twist into SKOV3 cells after different time

A：对照；B：转染36 h后；C：转染48 h后；D：转染54 h后。

2.4pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞克隆形成能力的影响过表达组细胞的克隆计数(61.67±4.69)明显多于对照组(32.50±2.81)及空载体组(33.17±3.18)，差异具有统计学意义(P<0.05)，对照组和空载体组相比，差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

3 讨 论

Twist基因于1983年在果蝇中首次发现，此后在包括人类在内的多个物种中相继被确认，其序列在物种进化过程中高度保守。人Twist基因定位于7p21.2，含2个外显子和1个内含子，编码的mRNA全长1 669 bp。第 1个外显子长772 bp，包含整个编码区域，其内的开放可读框共609 bp，编码组成Twist蛋白的202个氨基酸；内含子长度538 bp。Twist蛋白分子质量为26 ku，等电点为9.591，此蛋白属于螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)蛋白家族。

图3TwistmRNA和Twist蛋白的表达

Fig.3 Expressions of Twist mRNA and Twist protein

K：空白组；N：空载体组；O：干预组。

图4pEGFP-N1-Twist对SKOV3细胞克隆形成能力的影响

Fig.4 The influence of pEGFP-N1-Twist on the colony-forming ability of SKOV3 cells

A：对照组；B：空载体组；C：过表达组。

早期的研究发现，Twist在胚胎发育过程中发挥着重要作用，能诱导果蝇原肠胚腹部细胞通过上皮-间质转化(EMT)失去细胞粘着后形成中胚层[2]。EMT是指细胞间及细胞与胞外间质间的连接改变、上皮细胞失去极性并脱离周围组织，细胞骨架重塑并获得迁移能力，由此上皮细胞转化为具有间质表型细胞的过程。其分子特征是上皮细胞标记物如黏附分子表达的减少、间质细胞标记物表达的增加，转化后的细胞形态上亦具有间质细胞的特征。近年来发现EMT是上皮性恶性肿瘤发展及浸润转移中的重要过程。Twist参与EMT的全过程并发挥重要作用[3]。Twist在胃癌、肝癌、乳腺癌、生殖系统、泌尿系统多种恶性肿瘤中表达均上调。Twist基因的表达上调与E-钙黏蛋白的表达下降、肿瘤的恶性程度高、耐药性增强以及患者生存率低密切相关[4-5]。体外实验证明Twist的过表达可降低E-钙黏蛋白的表达，促进EMT，增加肿瘤细胞迁移能力从而促进肿瘤细胞的转移[6-8]，在小鼠肺癌模型中Twist基因沉默后可阻止癌细胞的转移扩散[9-10]。

TWIST与恶性肿瘤的转移密切相关[11]，与卵巢癌的关系近年来亦被密切关注[12-13]。上皮性卵巢癌易复发转移，缺乏有效的治疗手段，病死率很高，严重危害女性健康。本实验构建了能够表达Twist基因的真核质粒pEGFP-N1-Twist，并利用Real-time PCR和Western blot验证目的基因能够被稳定的表达，同时通过pEGFP-N1-Twist使Twist基因过表达，阐明 Twist对卵巢癌SKOV3细胞的克隆形成具有促进作用，为进一步研究上皮性卵巢癌的发生、发展及浸润转移的机制奠定了基础。

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