三叶虫茶茶多酚提取工艺研究

贺百花

(1.湖南环境生物职业技术学院医药学院,湖南衡阳421001;2.南华大学药学与生物科学学院,湖南衡阳421001)

三叶虫茶茶多酚提取工艺研究

贺百花1,2

(1.湖南环境生物职业技术学院医药学院,湖南衡阳421001;2.南华大学药学与生物科学学院,湖南衡阳421001)

研究萃取-沉淀法从虫茶中提取分离茶多酚的影响因素.采用单因素循环法考虑各影响因素,得出三叶虫茶茶多酚的最优提取工艺.用回流法提取茶多酚,并用单因素循环法分别考察提取剂、沉淀剂、转溶酸、萃取次数对茶多酚提取率的影响,用紫外-可见分光光度法对提取液进行检测.用萃取-沉淀法从虫茶中提取分离茶多酚,以80%丙酮作提取剂,ZnCl2作沉淀剂,盐酸转溶的效果较为理想.结论表明,萃取-沉淀法提取分离虫茶中茶多酚,所需要的有机溶剂少,能耗低,纯度高,具有可行性.图4,表5,参14.

虫茶;萃取-沉淀法;茶多酚;分离

虫茶,是特种植物被特种昆虫取食后,经昆虫体内特殊的生理生化学反应排出粪粒,这种粪粒经加工后被人们当作茶用,故又名“虫酿茶”,民间叫“虫茶”[1],是仡佬族、彝族、苗族、土家族等少数民族的民间饮品和传统中药[2],具有抗氧化[3,4]、降血压[5,6]、降血糖[7,8]、抑菌[9]等作用,三叶虫茶中白杨素苷对溃疡性结肠炎有明显的抑制作用[10-12].

根据文献[1]对虫酿茶的命名规则,由米缟螟Aglossa dimidiata Haworth幼虫(又名米黑虫,属鳞翅目螟蛾科昆虫)取食三叶海棠植物(Malussiebodii)叶后排出的粪粒,经过加工处理,称为三叶海棠虫酿茶,简称三叶虫茶.茶多酚(三叶虫茶中的多酚类物质)是三叶虫茶中的主要有效成分,茶多酚其由黄烷醇类、花色素类、黄酮醇类、花白素类、酚酸及缩酚酸类等6类化合物组成.黄烷醇类即通常所称的儿茶素,约占茶多酚的70%,主要包括没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)、没食子儿茶素和儿茶素.

1 材料与仪器

1.1 实验材料

单宁酸标准品,三叶虫茶(湖南,2012年购于当地农民家),丙酮,无水乙醇,无水氯化钙,氯化镁,硫酸锌,氯化锌,硫酸,盐酸,氨水,乙酸乙酯均为分析纯.

1.2 仪器

800型离心沉淀器(上海手术器械厂);

磁力加热搅拌器(南汇电讯器材厂);

UV-265FW紫外-可见分光光度计(日本岛津);

恒温水浴锅(北京国华医疗器械厂);

SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市英峡予华仪器厂);

PHS-3C数字酸度计(杭州东星仪器设备厂)

1.3 实验方法

1.3.1 溶剂回流-沉淀剂沉淀提取

称取20 g或25 g虫茶于圆底烧瓶,加入100 mL溶剂(水、80%乙醇、80%丙酮),在一定的温度下(90℃,80℃,70℃)水浴加热回流,回流1 h,趁热抽滤,其滤渣再用100 mL溶剂回流40 min后趁热过滤,重复2次,合并2次滤液并水浴回收部分溶剂,定容至250 mL,即得粗提取液.取5 mL粗提取液加入一定量的固体沉淀剂(CaCl2,MgCl2,ZnCl2, ZnSO4),在磁力搅拌器上搅拌15 min,再用2 mol/L氨水调pH值到7.5左右,3 000 r/min离心分离,弃去上清液即得沉淀物,沉淀物用蒸馏水洗涤2次,每次5 mL,得茶多酚沉淀物.

1.3.2 转溶和乙酸乙酯萃取

在沉淀物中加入15 mL 2 mol/L酸(硫酸、盐酸)转溶15 min,并不断搅拌,以2 mol/L的氨水调pH值到4左右,离心分离,得到上清液称酸水.取得一定量酸水样品(5 mL或15 mL),加入20 mL乙酸乙酯萃取,将萃取液定容至25 mL,既得酯萃取液.水浴回收大部分酯,将浓缩液移至烧杯,在120～130℃条件下蒸发干燥即得茶多酚粗品,粗品可用作为抗氧剂用于食品加工,也可精致得到纯度较高的茶多酚.

1.3.3 检测

以不同提取溶剂、沉淀剂、转溶酸按照1.3.1与1.3.2项下的方法对茶多酚进行提取分离,得到的酯萃取液经稀释,以乙酸乙酯为空白,波长200～400 nm范围内扫描其图谱.测定275 nm处各样品的吸光度值.

取三叶虫茶茶多酚类物质供试液和 0.04 mg/mL的单宁酸对照液按照1.3.1与1.3.2项下的方法对茶多酚进行提取分离,得到的酯萃取液经稀释.分别置于1 cm石英比色皿中,在紫外分光光度计上,以乙酸乙酯为空白,测定200～400 nm的UV光谱.实验结果表明二者均在275 nm处有吸收峰.根据文献报道[13],多酚类物质在270～280 nm处有吸收峰.因此该文取不同条件下制得酯萃取液在在λmax275 nm处的吸光度测定萃取液中多酚类物质的含量,以此作为提取条件和工艺研究的评价指标[14].

取0.1 g单宁酸作为标准品溶于100 mL乙酸乙酯中,从中取1mL稀释至25mL所得溶液作标准液,此时标准液的浓度为0.04 mg/mL,测λmax处的吸光A为0.235,由此可按下式估计算出三叶虫茶中茶多酚以单宁酸计算的收率(%):

收率(%)=(A样/A标)*C标*D/W总*1 000.其中:A样——2.1,2.2,2.3,2.4,2.5中各样品吸收光度

A标为单宁酸标准液吸光度;

D为换算因子;

W总为虫茶的质量.

2 结 果

2.1 溶剂类型的影响

不同溶剂的提取物UV检测情况:

除按1.3.1与1.3.2项下的操作外,其它需要确定的处理条件(下面均简称为处理条件):虫茶20 g、0.3 g CaCl2作沉淀剂,用2 mol/L硫酸转溶,取5 mL酸水液用乙酸乙酯萃取,所得酯萃取液,从中取1 mL稀释至5 mL,以乙酸乙酯为空白测得UV光谱,(见图1),数据见表1.

图1 不同溶剂提取物UV图谱Fig.1 UV spectroscopy of different extracts

表1 溶剂类型的影响Tab.1 Influence of solvent

由实验可知,在浸提阶段所用的溶剂对茶多酚提取影响较大,并以水浸提的提取率最低,而以80%丙酮提取率最高.(因此考察其它因素时均用80%丙酮提取液)

2.2 转溶酸的影响

处理条件:虫茶20 g,80%丙酮作提取剂,0.3 gCaCl2作沉淀剂,不同酸转溶,取5 mL酸水液用乙酸乙酯萃取,得酯萃取液,从中取1 mL稀释至15 mL,以乙酸乙酯为空白测得UV光谱,(见图2),结果见表2.

图2 不同酸转溶提取物UV图谱Fig.2 UV spectroscopy of different acids conversion solution

表2 不同转溶酸的影响Tab.2 Influence of different acids conversion solution

由实验可知,盐酸转溶时茶多酚收益较好.

2.3 沉淀剂的影响

处理条件:虫茶25 g,80%丙酮提取,不同沉淀剂沉淀,2 mol/L HCl转溶,取15 mL酸水试样用乙酸乙酯萃取,从中取2 mL稀释至25 mL,以乙酸乙酯为空白测得UV光谱,(见图3),结果见表3.

图3 不同沉淀剂提取物UV图谱Fig.3 UV Spectroscopy of Different Precipitant

表3 沉淀剂的影响Tab.3 Influence of different precipitant

由实验结果可以看出:沉淀剂以MgCl2收率最低,以ZnCl2的收率最高.

2.4 萃取次数的确定

处理条件:虫茶20 g,0.305 g ZnCl2作沉淀剂,盐酸转溶,取15mL酸水液用20mL乙酸乙酯萃取,得酯萃取液,从中取2 mL稀释至25 mL,测UV,其酸水液再用10 mL乙酸乙酯萃取后,定容至10 mL,以乙酸乙酯为空白测得UV光谱,数据见表4

图4 不同萃取次数UV图谱Fig.4 UV Spectroscopy of different extraction times

表4 萃取次数的影响Tab.4 Influence of different extraction times

由上述可知,第一次乙酸乙酯萃取液中的茶多酚以单宁酸计算浓度为3.960 mg/mL,第二次乙酸乙酯萃取液中浓度为0.197 mg/mL,两次萃取溶度比为20.1倍,第一次与第二次萃取的质量比为40.2.

2.5 优化工艺的平行实验

处理条件:虫茶20 g,80%丙酮作提取剂,0.405 g ZnCl2作沉淀剂,盐酸转溶,取5 mL酸水液用乙酸乙酯萃取,得酯萃取液,从中取1 mL稀释至15 mL,做三个平行实验,测UV,数据见表5

表5 优化工艺平行实验Tab.5 Parallel experiments of optimized techniques

由此可得出,三叶虫茶中茶多酚的收率为14.57%,其收率的RSD为0.4%,说明该法茶多酚的提取率较高,重复性良好,工艺稳定.

3 讨 论

近年来,因茶多酚临床作用和保健作用研究颇多,茶多酚的提取和分离受到国内外学者广泛关注.茶多酚的提取方法主要有:离子沉淀法、溶剂提取法、超临界流体萃取法、树脂吸附分离法、微波浸提法、盐吸法、超声波浸提法和低温纯化酶提取法等方法.但从国内已有报道看,茶多酚提取率很低(不到15%),这可能与茶多酚结构有关,茶多酚以儿茶素类黄烷醇,儿茶素类化合物结构中有多个苯酚基,在空气中极易被氧化,所以在实际操作过程中,茶多酚提取率偏低.目前,三叶虫茶中茶多酚的提取分离研究不多,其提取率也不高,提取工艺还需要进一步改进.该实验用萃取-沉淀法提取分离茶多酚,其原理及存在问题如下:

三叶虫茶由于包含茶多酚等物质而呈酸性,它能够与水溶液中的金属离子作用形成沉淀,因而能利用这一原理将茶多酚沉淀,与其它物质分离.用方程式可表示为:

但对于不同金属离子形成沉淀的能力不同.各离子沉淀的环境也有区别,偏碱性沉淀剂能诱发茶多酚的氧化反应,对于ZnSO4,ZnCl2来说,Zn2+较适合在弱酸性环境,与茶多酚提取适宜环境接近,有利于茶多酚提取分离.以它们为沉淀剂茶多酚的收率较高的主要原因是由于Zn2+具有3d10电子结构,与茶多酚可以形成络合型沉淀,存在水中的茶多酚沉淀得较为完全.用平衡式可表示为: [Ⅱ]可与Zn2+形成络合沉淀,使得上述平衡右移,茶多酚沉淀较完全.因此采用Zn2+作沉淀剂,既可保证较高的产品收率,又可避免采用Al3+,Ba2+等离子对产品安全性造成的严重影响.

该文茶多酚的检测用的对照物是单宁酸,单宁酸不是单一化合物,而是混合物,化学成分比较复杂,大致可分为两类,一类是缩合单宁,即黄烷醇衍生物,分子中黄烷醇的第2位通过C-C键与儿茶酚或苯三酚结合.一类是可水解的单宁,分子中具有酯键,是葡萄糖的没食子酸酯.其分子式: C76H52O46,分子量:1 701.22,单宁酸和茶多酚紫外吸收类似,所以用单宁酸做对照品.

该实验得出优化工艺的提取剂为80%的丙酮,但因丙酮毒性较大,而乙醇的毒性相对小,所以在实际的工业化生产中,常用80%的乙醇做提取剂.优化工艺的转溶酸为2 mol/L盐酸,实际工业化生产中要注意控制pH.pH值不仅影响着茶多酚络合物转溶效果,而且还影响着茶多酚的稳定性.pH值的波动大,容易引起茶多酚的氧化反应.优化工业的沉淀剂为ZnSO4,而有关文献报道用Zn2+和Al3+复合离子沉淀分离三叶虫茶中的茶多酚效果好,但该文并未选择Al3+作沉淀剂是因为Al3+会引发老年痴呆症,Al3+的过分残留可能限制茶多酚的应用范围.

[1]文礼章.中国昆虫学会2000年学术年会议论文集[M].北京:中国科学技术出版社,2000.

[2]雷 鸣,卢晓黎.中国虫茶资源及研究现状[J].食品科学,2001,22(11):100-102.

[3]敖 纯.虫茶醇提取物对超氧阴离子和羟基自由基的清除作用[J].肉类研究,2010,(4):61-64.

[4]陈会良,商常发.抗衰老中药对自由基清除作用的研究进展[J].中国中医药杂志,2007,5(8):14-17.

[5]文礼章,易定宏,陈晓阳,等.三叶虫茶对肾性高血压模型大鼠的影响[J].中国中医药信息杂志,2006, 13(12):33-35.

[6]陈晓阳,文礼章,李 晟,等.三叶虫茶对肾性高血压大鼠神经免疫调节作用的实验研究[J].湖南中医学院学报,2006,26(2):4-6.

[7]杜红霞,李洪军,李晓勇.辅助降糖保健食品的研究现状[J].中国食物与营养,2006,(9):18-21.

[8]诸凤丹,文礼章,朱 亮,等.三叶虫茶及其产茶植物的降血糖作用研究[J].华中昆虫研究,2010,(6):45-49.

[9]谭周进,文礼章.几种药用虫茶浸提液的抑菌特征研究[J].食品科学,2002,23(6):104-107.

[10]林 艳,文礼章,彭新君,等.三叶虫茶的有效部位抗大鼠溃疡性结肠炎的研究[J].湖南中医药大学,2008,28 (6):41-44.

[11]伍菊英.三叶虫茶治疗溃疡性结肠炎31例疗效观察[J].湖南中医药大学学报,湖南中医学院学报,1997, 17(3):27-28.

[12]许光明,林 艳,吴 萍,等.三叶虫茶抗大鼠溃疡性结肠炎的有效部位初步研究[J].中药材,2009,32(6): 943-945.

[13]许光明,彭新君,王彩君,等.三叶虫茶中茶多酚物质离子沉淀法提取工艺研究[J].湖南中医药大学学报, 2007,27(2):46-49.

[14]Roger A R,Valentino JS.Pharmaceutical applications of cyclode-xtrins.2.in vivo drug delivery[J].J.Pharm sci, 1996,85(11):1142.

Study on Extraction Techniques of Trilobite Tea Polyphenols

HE Bai-hua1,2

(1.School of Medicine,Hunan Polytechnic of Environment and Biology,Hengyang 421005,China;2.School of Pharmaceutical and Biological Science,University of South China,Hengyang 421001,China)

Analysis of the factors that influenced the extraction and separation of tea polyphenols from trilobite tea with themethod of extraction-precipitation.To find out the best technique to extract trilobite tea polyphenols bymeans of single factor circle.Circumfluence process was used to extract tea polyphenols.Single factor circlemethod was carried out to investigate the influence of extractant,precipitant,acids conversation solution and extraction times on the extraction rate of tea polyphenols.UV spectrophotometry was applied to test the extracting solution.Acids conversation solution was rather satisfying when 80%acetone as extraction and Zncl2as precipitant were made.The method of extraction-precipitation,which is characterized with less organic solvent needed,less energy consumed aswell as higher purity,was feasible to extract tea polyphenols.4figs.,5tabs.,14refs.

trilobite tea;extraction-precipitation;tea polyphenols;sepatation

R284.2

A

2095-7300(2014)04-040-05

2014-09-03

贺百花(1983-),女,湖南衡阳人,硕士,讲师,研究方向:中药学.