白细胞介素-1对新生大鼠内耳毛细胞再生能力的影响

王晓花，章建程，王庆敏，李中付，周宏元，袁海霞

·论著·

白细胞介素-1对新生大鼠内耳毛细胞再生能力的影响

王晓花，章建程，王庆敏，李中付，周宏元，袁海霞

目的 通过在新生SD大鼠毛细胞培养液中加入P27抑制剂白细胞介素-1(IL-1)，观察IL-1介导的细胞周期蛋白依赖性激酶/细胞周期蛋白D(CDK4/cyclinD)复合体表达增强对毛细胞再生能力的影响。方法 提取16只7 d龄SD大鼠的内耳基底膜上皮细胞层，按数字表法随机分为对照组(8只)和IL-1组(8只)，离体培养。观察培养第7天、第14天细胞生长情况，通过免疫组织化学方法检测毛细胞内CDK4、cyclinD的表达。结果 培养第7天，40倍光镜下3个随机视野内IL-1组毛细胞细胞球数量(139.33±13.50)个，与对照组［(69.00±12.49)个］相比明显增多，差异有统计学意义(P＜0.05);培养第14天，毛细胞细胞球数量仍然有增多趋势，但与对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。免疫组织化学结果显示，IL-1组毛细胞内CDK4和cyclinD表达增强，与对照组相比差异均有统计学意义(P＜0.05);CDK4和cyclinD阳性细胞率［分别为(48.23± 8.87)%和(28.43±1.34)%］增高，与对照组［分别为(35.03±1.94)%和(17.43±2.20)%］相比差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 IL-1可能对新生大鼠毛细胞的再生有一定的促进作用。

毛细胞;再生;离体培养;白细胞介素-1

近年来有文献报道，新生SD大鼠耳蜗内存在一种具有高度自我增殖能力的细胞，体外培养下可以诱导分化为具有毛细胞和神经元标志物的细胞。周期依赖性蛋白激酶抑制因子p27选择性地表达于支持细胞表面，抑制支持细胞的分化。同时，p27作为细胞周期负性调控因子，与细胞周期蛋白(cyclin)相互竞争结合细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclindependent kinase，CDK)，从而抑制细胞周期正性调控蛋白cyclin-CDK全酶的活性［1-2］。cyclin-CDK2和cyclin-CDK4复合体是细胞周期中催化细胞由G1期进入S期的关键酶，能够抑制Rb蛋白的功能。Rb基因编码的核内磷酸化蛋白Rb对毛细胞细胞周期有抑制作用，如果有效关闭该基因，则可促使毛细胞自身分裂。本实验通过在新生SD大鼠毛细胞培养液中加入P27的抑制剂白细胞介素-1(IL-1)，通过降低毛细胞内P27的表达，从而促进支持细胞转化为毛细胞;同时增强cyclin-CDK4复合体的表达，抑制Rb蛋白的功能，促进毛细胞自身分裂，观察IL-1对毛细胞再生能力的影响。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 SD大鼠16只，鼠龄7 d，由海军医学研究所实验动物中心提供。按数字表法随机分为2组:对照组(8只)，提取耳蜗毛细胞，在无血清培养液中培养;IL-1组(8只)，提取耳蜗毛细胞，在无血清培养液中加IL-1(10μg/L)培养。

1.2 主要试剂与仪器 (1)主要试剂:IL-1 (Shenandoah公司)，10μg/L;DMEM/F12培养液(Invitrogin公司);B27 supplement(Invitrogin公司); bFGF，20μg/L(Invitrogin公司);EGF，20μg/L(Invitrogin公司);青霉素G(Sigma P-7794)，2.5mg;多聚赖氨酸(SIGMA公司);0.125%的胰蛋白酶(SIGMA公司);4%多聚甲醛(SIGMA公司);羊抗小鼠的二抗FITC(DSHB公司);CyclinD抗体(Santa Cruz公司);CDK4抗体(Santa Cruz公司)。(2)消化酶溶液的配制:将嗜热菌蛋白酶(Thermolysin，Sigma公司)溶于pH 7.4的D-Hank溶液中，浓度为0.5 g/L。(3)无血清培养液成分:DMEM/F12培养液、B27 supplement、bFGF(20μg/L)、EGF(20μg/L)、青霉素G 2.5 mg。(4)主要仪器:解剖显微镜、尼康DIAPHOT倒置相差显微镜、激光共聚焦显微镜;Bio Photometer分光光度计(美国Eppendorf)、高速离心机、5%CO2培养箱。

1.3 耳蜗基底膜上皮层的分离与毛细胞培养 先用75%乙醇浸泡出生后7 d的2组大鼠进行消毒，然后将大鼠断头，完整取出听泡，置于0.01 mol/L、pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液中。在显微镜下打开听泡，小心地剥离蜗壳。由于新生的大鼠耳蜗尚未骨化，仅为软骨组织，可以完整地去除骨性耳蜗。去除螺旋韧带，自基底膜底转完整撕下基底膜，放入含有0.5 g/L嗜热菌蛋白酶的D.Hank溶液中，于体积分数为0.05的CO2孵箱(37℃)内进行25 min酶消化。酶消化后，耳蜗上皮组织和结缔组织之间的结合会变得较为疏松，在高倍显微镜下，用超细钨丝刀将包括大上皮嵴、小上皮嵴、内毛细胞和外毛细胞在内的一层大鼠耳蜗基底膜上皮层组织自基底膜上铲下。再经过0.125%的胰蛋白酶消化15 min，用含有10%胎牛血清(FBS)的培养液终止消化，1 500 r/min离心3 min(离心半径3 cm)，弃上清，用配好的2ml无血清培养液重悬细胞。接种至直径35mm的培养皿中，放置在37℃、5%CO2培养箱内。

细胞悬浮培养14 d，培养期间隔天换液，每日在倒置相差显微镜下观察培养基颜色、透明度及细胞生长情况。第14天计数结束后，将悬浮培养的细胞贴壁培养7 d:培养皿中放入盖玻片，涂抹多聚赖氨酸，将细胞悬液滴在盖玻片上，待24 h后，悬浮的细胞球基本贴紧玻片后，加入含10%FBS的培养液，隔天换液，第7天固定染色。

1.4 细胞球计数 按前述的耳蜗分离与细胞培养方法，培养至第7天和第14天，在低倍(40倍)倒置相差显微镜下，随机取3个视野进行细胞球计数。计数标准:(1)细胞球的形态为圆形或椭圆形;(2)细胞球直径在1.0 cm或以上;(3)如2个或数个细胞球重叠在一起，则按1个细胞球计数;(4)仅计数悬浮的细胞球，贴壁的细胞球不计入。

1.5 cyclinD、CDK4的检测 采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶连接(SP)免疫组织化学方法。具体操作步方法:细胞甩片经3 ml/L Triton X-100/PBS、10 ml/L H2O2/PBS处理后，用正常兔血清封闭，37℃温育 30 min。分别滴加兔抗大鼠 cyclinD (1∶100)和CDK4(1∶100)多抗(一抗)，4℃过夜。次日晨滴加山羊抗兔IgG血清(1∶200，二抗)，37℃温育30 min。滴加SP复合物，37℃温育30 min(以上各步间均以PBS充分振洗)。DAB显色，室温5 min，PBS振洗中止显色反应，苏木精衬染，逐级乙醇脱水后二甲苯透明，中性树胶封片;阴性对照用PBS代替一抗，其他同前。

1.6 结果判定 cycinD阳性着色定位于细胞核，CDK4阳性着色定位于细胞核和细胞质，以细胞中相应部位出现红色或绿色颗粒为阳性细胞。每张片选择5个典型的高倍(200倍)视野，计数至少500个细胞，并计数5个视野中的细胞总数及阳性细胞数，然后计算出每张片的阳性细胞百分率(参考:阳性细胞率≥10%为阳性，＜10%为阴性)。

2 结果

40倍光镜下，培养第7天IL-1组毛细胞细胞球数量增多，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);培养第14天，毛细胞细胞球数量仍存在增多趋势，但与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。免疫组织化学测定结果显示，IL-1组CDK4和cyclinD阳性细胞率增多，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05);且荧光强度(以单位面积内光密度IOD/area计)增强，与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05)。显微镜下毛细胞内绿色为CDK4阳性表达，红色为cyclinD阳性表达。结果见表1及图1、2。

图1 2组悬浮培养14 d和贴壁培养7 d后CDK4表达组织图(免疫组化 ×200)

3 讨论

内耳毛细胞是机械-电感受器，对维持听觉和平衡觉起着关键作用。任何原因导致的内耳毛细胞的变性、坏死均可引起听觉和平衡功能障碍［3-6］。因此，对内耳毛细胞的再生研究一直是重点。近年来的研究发现，将新生大鼠耳蜗Corti器进行体外细胞培养，可见细胞球形成，且细胞球内细胞能被Brdu标记，认为其内存在一种增殖细胞，该增殖细胞存在于基底膜的大上皮嵴区域，可以诱导分化为具有毛细胞和神经元标志物的细胞。

图2 2组悬浮培养14 d和贴壁培养7 d后cyclinD表达组织图(免疫组化 ×200)

内耳毛细胞发育、分化及再生机制的研究，因内耳结构复杂、部位深在、组织来源少、分离出的组织对环境变化敏感、活性难以保持而受到一定限制。体外组织细胞培养条件下的实验研究避免了全身因素的干扰和影响，使实验条件更加纯化，有利于研究组织细胞在单因素改变下的变化规律和变化机制，研究途径更为便捷可靠［7］。一般认为，哺乳动物的毛细胞是一种高度分化和稳定的感觉细胞，具有恒定的DNA总量，通常不再具有分裂增殖能力，因此毛细胞的离体培养较其他组织细胞的培养技术具有更高的要求和难度［8-9］。耳蜗器官培养的材料大多采用出生数天的小鼠或者大鼠，主要是因为小鼠和大鼠在出生后数天尚未完全骨化，比较容易对耳蜗内结构进行分离和取材。同时此阶段小鼠和大鼠的耳蜗细胞尚未发育完全处于比较原始阶段，因此比较容易培养成功［10-11］。

本实验提取了新生大鼠耳蜗基底膜上皮细胞，进行离体培养，观察IL-1对新生大鼠毛细胞再生能力的影响。结果显示:培养第7天，IL-1组毛细胞细胞球数量与对照组相比明显增多;培养第14天，毛

表1 2组毛细胞培养不同时间后细胞球数量及免疫组织化学测定结果(±s，每组n=8)

表1 2组毛细胞培养不同时间后细胞球数量及免疫组织化学测定结果(±s，每组n=8)

注:IL-1为白细胞介素-1;CDK4为细胞周期蛋白依赖性激酶;cyclinD为细胞周期蛋白D;IOD/area为单位面积内光密度值。与对照组比较aP＜0.05

组别 细胞球数量(个)第7天 第1 4天C D K 4荧光强度( I O D / a r e a ) C D K 4阳性细胞率( % ) c y c l i n D荧光强度( I O D / a r e a ) c y c l i n D阳性细胞率( % ) a对照组 6 9.0 0 ± 1 2.4 9 3 8.0 0 ± 9.5 4 6 2.9 2 ± 8.5 3 3 5.0 3 ± 1.9 4 6 7.0 1 ± 5.9 2 1 7.4 3 ± 2.2 0 I L -1组 1 3 9.3 3 ± 1 3.5 0a4 1.0 0 ± 6.2 5 7 6.7 7 ± 6.4 9a4 8.2 3 ± 8.8 7a7 7.0 4 ± 7.8 9a2 8.4 3 ± 1.3 4

细胞细胞球数量仍然有增多趋势，且免疫组织化学结果显示，毛细胞CDK4和cyclinD表达增强，CDK4和cyclinD阳性细胞率增高。这一结果初步说明，IL-1对新生大鼠毛细胞的再生可能有一定的促进作用。可能机制:IL-1通过抑制周期依赖性蛋白激酶抑制因子p27的表达，一方面促进了支持细胞分化为新的毛细胞;另一方面促进cyclin/CDK4复合体的表达，抑制了Rb蛋白的功能，催化毛细胞由G1期进入S期，促使毛细胞自身分裂。在培养第14天，IL-1组毛细胞细胞球数量与对照组相比呈增多趋势，可能原因为毛细胞周期中潜伏期约48 h，倍增时间24～36 h，指数增生期持续2～4 d，培养1周后，毛细胞细胞球达80%融合，而后增殖能力受到一定的抑制，该细胞具有接触抑制能力。

内耳毛细胞的发育和再生是一个复杂的问题，研究人员一直在探索通过外源性的生长因子或通过基因治疗的办法来解决损伤后毛细胞再生的问题。经过各国学者20多年的研究，在毛细胞再生方面已取得了突破性的进展，如果基因治疗临床应用成功，将会有效解决因为毛细胞的变性坏死导致的听力障碍和平衡功能障碍。

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Effect of IL-1 on the regeneration of the inner ear hair cells in newborn rats

WANG Xiao-hua，ZHANG Jian-cheng，WANG Qing-min，LIZhong-fu，ZHOU Hong-yuan，YUAN Hai-xia

(Naval Medical Research Institute，Shanghai200433，China)

Objective To observe the effectof enhanced expression of CDK4/cyclinD complex on the regeneration of hair cells in newborn rats through addition of P27 inhibitor IL-1 into the culture.Methods The epithelium collected from the supportingmembrane of the inner ear in the 167 day old ratswere cultured in vitro and the animalswere divided into 2 groups:the blank control group and the IL-1 group，each consisting of8 rats.Cell growth was observed respectively at day 7 and day 14，and the expressions of CDK4 and cyclinD in hair cells were detected by immunohistochemistry.Results At day 7 after culture，the number of cell balls of hair cells(139.33± 13.50)in the IL-1 group increased significantly in 3 randomized visual fields under the electron lightmicroscope，when itwas compared with that of the blank control group(69.00±12.49)，and statistical significance could be noticed，when comparisonsweremade between them(P＜0.05).At day 14 after culture，the number of cell balls of hair cells still displayed an increasing trend，butwithout statistical significance(P＞0.05).Immunohistochemistry revealed that the expressions of CDK4 and cyclinD(76.77±6.49 and 77.04±7.89)in hair cells of the IL-1 group were enhanced，butwithout statistical significance(P＞0.05)，as compared with those of the control group (P＞0.05).Positive rates of CDK4 and cyclinD were respectively increased(48.23±8.87 and 28.43±1.34)，and statistical significance could be seen，as compared with those［(35.03±1.94)%and(17.43±2.20)%］of the control group，with statistical significance(P＜0.05).Conclusion IL-1might have a certain enhancing effect on the regeneration of hair cells in newborn rats.

Hair cell;Regeneration;In vitro culture;IL-1

R764

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.004

2013-09-12)

(本文编辑:施 莼)

200433 上海，海军医学研究所