过表达LncRNA-MEG3对肠癌细胞Lovo增殖活性的影响

章杰兵，徐燕茹，邱 彦，霍中华

·论著·

过表达LncRNA-MEG3对肠癌细胞Lovo增殖活性的影响

章杰兵，徐燕茹，邱 彦，霍中华

目的 用PCR扩增长链非编码RNA-MEG3，构建MEG3真核表达载体，将重组质粒转染人肠癌细胞Lovo，观察MEG3含量改变对Lovo细胞增殖活性的影响。方法 用293细胞提取人总RNA，反转录制备cDNA，PCR扩增MEG3基因并构建克隆，阳离子脂质体法转染重组质粒至Lovo细胞，转染后48 h通过荧光标记物GFP观察细胞转染效率。RealTime-PCR检测转染后细胞内MEG3含量变化。CCK-8检测肿瘤细胞对数生长期基因干预对于增殖活性的影响。结果 成功获取了MEG3基因并构建了重组表达载体;成功转染Lovo细胞，转染后48 h，细胞转染效率约为60%;转染后细胞内MEG3含量明显升高，与空质粒转染组比较，相对含量上升约6.8倍，差异有统计学意义(P＜0.01);外源MEG3的高表达可抑制Lovo细胞增殖活性，基因干预后48、72 h，与未转染组及转染对照组细胞比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论 LncRNA-MEG3可显著抑制Lovo细胞增殖活性。

LncRNA;Lovo;MEG3;细胞活性

肠癌是目前世界范围内消化系统中常见的恶性 肿瘤，发病率仅次于胃和食管癌，是大肠癌的最常见部分，全世界每年因病致死率约为40万［1］。虽然我国的发病率原本不高，但近年来随着国民饮食和生活习惯的改变，其发病率逐渐上升，并且以平均每年4.2%的速率递增［2］。因此，探索肠癌新的发病机理，寻找新的治疗途径，已成为提高全民健康的迫切要求。

长非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)一般是指内源性，长度大于200个碱基的RNA序列，母系表达基因 3(materally expressed gene 3，MEG3)是第一个被发现有肿瘤抑制功能的 lncRNA［3］。MEG3作为肿瘤抑制因子，在脑膜瘤、神经胶质瘤及血液瘤中已经得到证实［4］，而其在肠癌细胞中的作用未有见相关报道。

1 材料与方法

1.1 材料

正常人肠上皮细胞FHC、肠癌细胞株Lovo购于上海中科院细胞所;胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶，F-12K培养基、Lipofectamine2000转染试剂及Trizol均为Invitrogen公司产品;细胞培养耗材为BD公司产品;pCDF1-copGFP vector购于美国System Biosciences公司;限制性内切酶XbaI和EcoR I、DH5α感受态细胞、DNA Marker、M-MLV反转录试剂盒、连接酶、DNA回收试剂盒、荧光定量试剂盒等购于大连宝生物工程有限公司;定量检测PCR管及无菌离心管为Axygen公司产品;CCK-8细胞活性检测试剂盒购于日本同仁化学;质粒提取试剂盒购于Qiagen公司;细胞培养箱为日本三洋公司产品，移液器、离心机为Eppendof公司产品;定量PCR、梯度PCR仪均为Takara公司产品，电泳仪为上海天能公司产品，酶标仪及紫外分光光度计为Thermo公司产品;引物合成及测序在上海Invitrogen公司完成。

1.2 方法

MEG3重组表达载体构建Lovo细胞转染、MEG3含量测定、CCK-8检测细胞活性方法参考文献［3］。

根据MEG3(NR_002766.2)的RNA序列信息，设计PCR扩增引物，上下游引物分别添加酶切位点Xba I及EcoRΙ及保护碱基，上游引物添加kozak序列。PCR引物序列:Forward primer-MEG3:5＇-TCTAGA(Xba I)GCCACC(kozak)AGCCCCTAGCGCAGA-3＇;Revese primer-MEG3:5＇-GAATTC(EcoR I)TTGTTAAGACAGGAAACAC-3＇，PCR长度为1 592 bp。Real Time-PCR检测，引物序列:Beta actin-forward primer，5＇-CCTGTACGCCAACACAGTGC-3＇，Beta actin-reverse primer 5＇-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3＇，PCR产物长度为211bp;MEG3-forward primer 5＇-TGCGGATGGAAGCTGCGGAAGAG-3＇，MEG3-reverse primer 5＇-CGCCCAAACCAGGAAGGAGACGAG-3＇，PCR产物长度为102 bp。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析，数据结果采用均数±标准差(±s)表示，采用析因分析进行组间差异及组内差异的比较。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 目的基因获得

通过PCR的方法成功得到目的基因，根据DNA Marker判断PCR扩增产物大小与理论值(1 592 bp)完全相符合，PCR反应体系无条带，说明体系未受到污染。见图1。

图1 PCR扩增目的基因琼脂糖凝胶电泳图

2.2 克隆构建

成功构建了MEG3基因真核表达载体，阳性菌落检测结果见图2，其中2、4号克隆有目的基因插入，且大小与理论值相符，选取4号克隆提取质粒，用载体多克隆位点上游的通用引物对重组质粒进行测序，测序结果经与标准序列比对，完全一致。

图2 PCR检测阳性菌落琼脂糖凝胶电泳图

2.3 Lovo细胞转染效率检测

转染后48 h，使用荧光倒置显微镜观察细胞，通过荧光标记物GFP的表达判断，细胞基因导入效率约为90%。见图3。

图3 Lovo细胞转染HE染色图

2.4 转染后Lovo细胞内MEG3相对含量分析

以Ct值分析MEG3的相对含量，以Beta actin作为参照基因。数据分析显示，Lovo细胞转染后实验组细胞MEG3相对含量明显上升，与空质粒转染组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);而转染空质粒对细胞内MEG3相对含量无明显影响(P＞0.05)。见图4。

图4 RNA含量检测

2.5 MEG3过表达对Lovo细胞增殖活性影响检测

使用pcDNA-MEG3及对照质粒转染Lovo细胞，转染后细胞培养24、48及72 h，CCK-8检测细胞活性。检测结果显示，在对数增殖期，MEG3含量升高能够明显抑制Lovo细胞增殖活性，转染后48、72 h，与对照组细胞相比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。转染空质粒对照组细胞活性与未转染组(Lovo组)比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，这说明转染试剂及实验本身对细胞增殖活性无明显影响。见图5。

图5 细胞活性检测

3 讨论

进一步研究和揭示结肠癌的分子发病机制，寻找新的治疗途径和基因治疗靶点，一直以来都是肠癌相关研究领域的热点，对于我国这样的人口大国，直接关系到全民健康水平。LncRNA起初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，是基因转录的“噪音”，因此其不具有生物学功能。然而，近年研究表明，LncRNA具有诸多生物学功能:其参与染色体沉默、染色质修饰、转录调控等多种生物学过程［5-7］;以多种形式影响蛋白功能;影响 miRNA含量。LncRNA的作用方式如下:(1)影响基因启动子区域，从而干扰邻近蛋白编码基因的表达;(2)抑制RNA聚合酶Ⅱ，或介导染色质重构和组蛋白修饰，而影响基因表达;(3)与基因的转录本形成互补双链，进而影响基因转录效率及剪切形式;(4)结合在特定蛋白质上调节相应蛋白的活性;(5)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体;(6)结合在特定蛋白上从而改变该蛋白的胞质定位;(7)可作为miRNA的前体分子［8］。

现有研究证实，肿瘤的形成及发展，与lncRNA异常密切相关。第二军医大学孙树汉教授课题组，首次发现了能抑制肝癌转移的新 LncRNA-Dreh。Gabory A等［9］研究发现LncRNA H19与肿瘤发生密切相关。LinR等［10］在2007年发现，肝癌细胞中LncRNA-MALAT1具有异常表达，其与肿瘤具有相关性。lncRNA还被证实与肝癌的耐药性有关，位于染色体19p13.1，CUDR lncRNA可通过抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达而引起细胞增殖活性增强，当其表达下调后细胞对化疗药物变得不敏感，产生耐药［11］。

本实验通过构建MEG3重组表达载体，脂质体瞬时转染人肠癌细胞株Lovo，MEG3相对含量检测结果说明，通过质粒转染的方法可以在Lovo细胞中高效表达外源性MEG3。细胞活性检测结果则说明，外源性MEG3的高表达可明显抑制Lovo细胞增殖活性，MEG3含量水平与肿瘤细胞增殖活性具有负相关性，提示MEG3具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，其可成为肠癌治疗潜在的基因靶点，为肠癌的临床治疗提供新的理论依据。

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Effect of LncRNA-MEG3 over-expression on the proliferation activity of colorectal cancer Lovo cells

ZHANG Jie-bing，XU Yan-ru，QIU Yan，HUO Zhong-hua

(Drug and Instrument Control Institute，Joint Logistic Command，Nanjing Military District，Nanjing 210002，China)

Objective To investigate the effect of the changes in MEG3 level on proliferation activity in Lovo cells，through the amplification of the non-coding RNA-MEG3 by PCR and the construction of a eukaryotic expression vector forMEG3，which was transfected into a human colon cancer cell line，Lovo.Methods cDNA was prepared from the total RNA extracted from 293 cells by reverse transcription and MEG3 genewas amplified by PCR and was used to construct a recombinant plasmid，which was transfected into Lovo cells by using cationic liposome.Transfection efficiency was evaluated by observation on the expression of GFPmarker48 hours after transfection，and changes in MEG3 contentwere detected by RT-PCR(Real-time-PCR).CCK-8 was used tomeasure the effect of genetic intervention on proliferative activity in tumor cells in the logarithmic growth phase.Results MEG3 gene was successfully obtained and the recombinant expression vectorwas constructed.Lovo cellswere successfully transfected，and 48 hours after transfection，the transfection efficiency reached as high as60%.MEG3 level in transfected cellswas significantly increased for approximately 6.8 folds，as compared with that of the transfected control group(P＜0.01).High expression ofexogenousMEG3 in Lovo cells could inhibit cell proliferation，and significant differences could be noted at hours 48 and 72 after the genetic intervention，as compared with those of the untransfected group and the transfected control group(P＜0.01).Conclusion LncRNA-MEG3 could obviously inhibit the proliferation of Lovo cells.

LncRNA;Lovo;MEG3;Proliferation activity

R735.3

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2014.05.005

210002 南京，南京军区联勤部药品仪器检验所(章杰兵);南京军区卫生部(徐燕茹);解放军第四五四医院(邱彦、霍中华)

霍中华，电子信箱:nky454@126.com