TIP30基因表达对吉非替尼体内抑瘤作用的影响研究

陈锦章，黄维，郑大勇，阮健，陈逢生，李爱民

(1.南方医科大学南方医院肿瘤内科，广东广州 510515；2.顺德第一人民医院肿瘤科，广东顺德 528300)

TIP30基因表达对吉非替尼体内抑瘤作用的影响研究

陈锦章1，黄维2，郑大勇1，阮健1，陈逢生1，李爱民1

(1.南方医科大学南方医院肿瘤内科，广东广州 510515；2.顺德第一人民医院肿瘤科，广东顺德 528300)

目的探讨TIP30基因的表达与吉非替尼体内抑瘤作用的相关性。方法选取小鼠24只，随机分为实验组和对照组，每组12只。两组小鼠均经皮下种植肺癌细胞获得肿瘤模型，实验组通过沉默TIP30基因建立TIP30低表达模型，对照组裸鼠则不作任何处理，利用实时定量PCR和Western blot方法检测两组TIP30基因的表达情况。对两组小鼠未用吉非替尼10mg/d进行处理，15 d后观察两组小鼠的体内肿瘤抑制程度。结果成功建立小鼠肺癌模型，实验组TIP30表达情况显著低于对照组，两组表达情况比较差异具有统计学意义(P＜0.01)。对两组小鼠利用吉非替尼进行处理后，在第5天两组的瘤体平均重量未见显著差异，但第7天及第15天实验组瘤体重量显著低于对照组(P＜0.05)，病理切片显示实验组肿瘤抑制效果明显强于对照组。结论TIP30基因对吉非替尼的体内抑瘤作用具有促进作用。

TIP30；肺癌；表皮生长因子受体；体内研究

近年来，我国的肺癌发病率呈逐年上升的趋势，对肺癌进行进一步的诊断和治疗显得尤为重要[1]。目前靶向药物治疗肺癌发展较为迅速，其中表酪氨酸蛋白激酶抑制剂——表皮生长因子受体(Epithelial grow th factor receptor，EGFR)在非小细胞肺癌的治疗中起着重要的作用[2]。TIP30是一种抑癌基因，最近几年研究表明其在多种肿瘤组织中表达均较正常组织有所下调，且敲除TIP30基因，可导致肿瘤的发生和转移[3-4]。有报道[5]TIP30在肺癌组织中的亦称低表达，但TIP30的表达情况与吉非替尼的抑瘤作用相关研究笔者未见报道。我们2012年10月通过肺癌的动物模型对TIP30的表达与吉非替尼抑瘤作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及细胞采用C57BL/6N的近交系小鼠24只，体重为18～22 g，鼠龄约8周，随机分为实验组和对照组，各12只。由南方医科大学实验动物中心提供；肺癌细胞株由上海抚生试剂公司提供。

1.1.2 实验药物吉非替尼由AstraZeneca(英国)公司提供，1640细胞培养基购自Hy-clone公司，PCR试剂盒购自Boeh-ringer公司、引物和DNA片段购自上海博亚有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌小鼠动物模型的建立采用慢病毒载体干扰实验组的内源性TIP30表达，采用Western blot及Qt-PCR定量检查TIP30基因的表达情况，确认实验组目标基因呈低表达状态，之后将在体外进行培养后处在对数生长期的肺癌细胞制成细胞悬液，并接种到小鼠皮下，部位选取右前肢，接种浓度为每只107个细胞。观察皮下肿瘤生长情况。两组小鼠分别于给药后5 d、7 d及15 d各处死4只，将所得组织进行重量的计算并行统计分析，之后进行病理切片检查。

1.2.2 病理学检查各组小鼠进行解剖获得肿瘤组织，通过10%福尔马林固定后，采用石蜡包埋、切片，进行依红-苏木精染色。成片后在光镜下进行肿瘤组织的观察，评价不同用药时间后的肿瘤恶性程度。

1.3 统计学方法采用SPSS13.0进行分析，两组大鼠的瘤体重量比较采用t检验。由于数据较少，且Rt-PCR定量数据和瘤体平均重量呈非正态分布，数据采用秩和检验进行分析，以P＜0.05为差异具有统计学意义。统计作图采用Graphpad 5.0进行绘制。

2 结果

2.1 两组TIP30表达情况实验组大鼠经基因沉默方法对TIP30基因进行沉默，各组随机取一只大鼠进行靶向基因表达检测。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参进行Western Blot检测，结果显示TIP30在实验组中表达量显著少于对照组(图1)，且Rt-PCR结果也显示上述差异具有显著统计学意义(P＜0.01，图2)。

图1 实验组大鼠沉默TIP30基因后TIP30表达情况

图2 RT-PCR检测两组细胞中TIP30水平差异情况

2.2 两组吉非替尼处理后效果两组大鼠均接受吉非替尼10mg/d处理后15 d观察瘤体组织显示，实验组瘤体缩小程度显著强于对照组(图3)。

图3 两组大鼠接受吉非替尼处理15 d后瘤体组织比较

2.3 两组大鼠病理结果比较在第5天、第7天及第15天对瘤体组织进行病理切片检查，均见实验组肿瘤细胞情况显著较对照组差(图4)。两组大鼠瘤体平均重量在第5天未见明显差异(t=0.30，P=0.77)，而在第7天(t=3.64，P＜0.01)及第15天(t=4.66，P＜0.01)差异具有统计学意义(图5)。

图4 两组大鼠在接受吉非替尼第5、7、15天的病理切片比较

图5 两组大鼠在接受吉非替尼第5、7、15天的瘤体平均重量

3 讨论

早期转移时肺癌的一大特征，也是肺癌患者治疗失败的主要原因之一。虽然目前已有众多的临床治疗手段，但至今肺癌的5年存活率仍较低[6]，在全世界各癌症的死亡人数中比例约高达17%[7]。故对于肺癌的早期治疗和新型治疗方法的探讨具有重大意义。目前随着分子生物学信号通路的研究，生物靶向治疗在临床上越来越受到重视[8]。其中在肺癌的临床治疗上较为成功的即为EGFR相关基因的突变与肺癌发生的研究，而TIP30蛋白属于新型肿瘤转移的抑制基因，文献显示它与EGFR之间具有一定联系[9]。对于该基因表达的上调和下调对EGFR靶向治疗药的效果是否具有增强或抑制作用尚未见有相关文献报道。

我们本次研究通过构建TIP30基因低表达肺癌的动物模型，采用EGFR抑制剂吉非替尼对TIP30正常的肺癌模型组合低表达TIP30基因的实验组进行了干预实验。结果显示实验组小鼠TIP30基因呈低表达，而两组在接受吉非替尼处理后，第5天两组的瘤体重量未见明显差异，而实验组第7天及第15天两组的瘤体重量减少程度均明显大于对照组小鼠。病理切片仍证实了随着时间变化，实验组的抑瘤效果明显强于对照组。

TIP30属于一种肿瘤抑制基因，文献报道在众多的肿瘤组织中均呈低表达情况[10-12]。有研究证明TIP30在肝细胞癌中的抑瘤作用可能是通过抑制ETS1蛋白及AP1等协同OPN启动子区域的nt266下调OPN表达从而抑制肝细胞癌的侵袭转移[13-14]。但这一机制并未在其他肿瘤组织中得以证实。

吉非替尼是EGFR的靶向小分子酪氨酸激酶抑制剂，其主要作用是抑制EGFR胞内区的酪氨酸激酶的活性。文献报道TIP30进行基因敲除后可加快EGFR细胞核内化，以及可使肺上皮干细胞及祖细胞数目增加，导致EGFR表达上调，激活EGFR下游信号通路，从而促进肺癌的发生和转移[15]。而我们研究发现TIP30基因抑制的小鼠对吉非替尼的敏感性更强，这提示TIP30可作为吉非替尼疗效的预测指标。

综上所述，TIP30的抑制可增强EGFR抑制剂吉非替尼的抑瘤敏感性，但是否还受诸如遗传等其他因素的影响仍需进一步研究。

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Correlation of TIP30 gene expression and the antitumor effect of gefitinib in the treatment of lung cancer in vivo.

CHEN Jin-zhang1,HUANGWei2,ZHENGDa-yong1,RUAN Jian1,CHEN Feng-sheng1,LIAi-min1.1.Department of Oncology,Nanfang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,CHINA;2.Department of Oncology,the FirstPeople's Hospital of Shunde,Shunde,528300,Guangdong,CHINA.

Objectivee To investigate the correlation of TIP30 gene expression and the antitumor effectof gefitinib in the treatmentof lung cancer in vivo.Methods Twelvemicewere random ly divided into experimental group and control group.Tumormodelwereestablished in two groups by subcutaneous injection of lung cancer cells.TIP30 low-expressionmodelwas established by silencing TIP30 genes in the experimentgroup;however,therewas no any treatment in the control group.Then we used the real-time quantitative PCR and western blotmethod to detect the TIP30 gene expression.Gefitinib were used in both groups in a concentrate of 10mg/d.As a result,both the anatom y and pathological effect of tumor inhibition were found after 15 days.ResultsThe lung cancermodels inmicewas successfulestablished.Real-time quantitative PCR and w estern blot confirmed thatexpression of TIP30 in experimental group was significantly lower than that in control group(P＜0.01).After the first five days there was no statistical difference between groups in theaverageweightof tumor on theuse of gefitinib,while therewere significant statistical differences between groups at the first7 days and 15 days(P＜0.05).PathologicalResultsalso showed that the tumor inhibitory effect in experimental group was significantly stronger than that in controlgroup.ConclusionTIP30 gene can havea facilitating role in theantitumoreffect in vivo.

TIP30;Lung cancer;Epithelialgrow th factor receptor(EGFR);In vivo

R-332

D

1003—6350（2014）04—0472—03

2013-08-26)

广东省自然科学基金（编号：S2012010009392）；南方医院院长基金（编号：2011C001）

李爱民。E-mail：Liaimin2005@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0184