子痫前期患者胎盘NF-κB的表达及其与细胞因子变化的相关性

陈芳荣，龚护民，茹美艳，施蕾，卢敏

（海南省人民医院妇产科，海南海口 570311）

子痫前期患者胎盘NF-κB的表达及其与细胞因子变化的相关性

陈芳荣，龚护民，茹美艳，施蕾，卢敏

（海南省人民医院妇产科，海南海口 570311）

目的探讨子痫前期患者胎盘NF-κB的表达及其与细胞因子的变化关系。方法选取在海南省人民医院妇产科住院的晚孕产妇120例，其中正常妊娠组40例，子痫前期组80例（轻度40例，重度40例）。采用免疫组化法检测胎盘NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α和Bcl-1的表达。采用ELISA法检测分娩前血清TNF-α、VCAM-1和IL-4水平。子痫前期组和正常妊娠组进行统计学分析，判断结果有无统计学意义。结果子痫前期组较正常妊娠组的胎盘NF-κB p65、VCAM-1表达明显升高；IκB-α、Bcl-1表达明显降低（P＜0.01）；子痫前期患者血清细胞因子TNF-α、VCAM-1水平明显高于正常妊娠组，IL-4水平明显低于对照组（P＜0.01）。结论子痫前期患者胎盘NF-κB活化增强与细胞因子表达密切相关，其参与免疫炎症反应及胎盘细胞损伤，加速子痫前期的发病过程。

子痫前期；NF-κB；细胞因子；炎症

子痫前期是妊娠期特有的疾病，是属于妊娠期高血压疾病的一种。子痫前期发病率在我国产妇中达9.4%～10.4%[1]，是导致孕产妇及新生儿死亡的主要原因之一。子痫前期的发病原因很多，可能与免疫机制、胎盘浅着床、血管内皮受损、遗传因素营养缺乏等有关，但至今临床均不能阐明其发病原因及发病机制。

迄今为止，临床上仍无有效的方法预防子痫前期。由于众多炎症介质构成复杂网络及炎症介质过度释放形成瀑布效应，拮抗单一炎症介质显得力不从心，只有采用干涉信号传导通路的“瓶颈”才可能从根本解决难题。核转录因子-κB(NF-κB)便是控制炎性因子基因表达的重要瓶颈之一，拮抗NF-κB活化，起到事半功倍的抗炎效果。大量实验证明NF-κB在炎症性疾病中起关键作用。本项目从母胎界面免疫、炎症、细胞因子的角度入手，检测子痫前期中胎盘NF-κB表达与细胞因子的变化关系，旨在探讨胎盘核转录因子-κB(NF-κB p65)、血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)、抑制性亚单位(IκB-α)、抗凋亡蛋白(Bcl-1)与血清细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮细胞粘附分子-1(VCAM-1)、白细胞介素-4 (IL-4)的相关性及其与子痫前期发生发展的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料随机选取2009年1月至2012年1月在海南省人民医院住院的晚孕患者120例，其中正常妊娠组40例，子痫前期患者80例(轻度40例，重度40例)。按2008年4月第七版妇产科制定的标准[2]进行诊断子痫前期，未临产、无妊娠并发症、无高血压史、肾病史及糖尿病史等其他合并症。对照组年龄(25.3±2.4)岁，孕周(35.3±4.6)周。轻度子痫前期组年龄(26.4±2.6)岁，孕周(33.2±5.2)周。重度子痫前期组年龄(26.8±3.2)岁，孕周(32.5±5.3)周。子痫前期组(轻、重)与正常妊娠组的年龄差异无统计学意义(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 标本采集及处理流程图询问病史，查体，查血尿常规、肝肾功能、凝血四项、心电图、心脏彩超等，确认符合入组标准：分正常妊娠组和子痫前期(轻、重)组。检测胎盘形态学、NF-κB表达及细胞因子水平。

1.3 各项观察指标及其检测方法

1.3.1 胎盘NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1的检测剖宫产时胎儿娩出后无菌操作下取两组研究对象胎盘组织，立即从胎盘母体面取胎盘组织块(避开钙化坏死区)，大小约1 cm×1 cm×1 cm。立即以10%福尔马林固定6～12 h后给予石蜡包埋，继而连续切片。以苏木素伊红(HE)染色复诊。再以免疫组化(通用二步法)检测胎盘NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1。观察结果采用双盲法。胎盘NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1的表达以光镜下在细胞胞浆出现的棕黄色颗粒为标准，无染色或与非特异性染色者一致的为染色阴性，其着色强度高于背景者判定为阳性。根据阳性细胞百分率及染色深浅确定NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1的表达水平。阳性细胞百分率分为：无细胞显色为-；小于25%细胞显色为+；25%～50%细胞显色为++；大于50%细胞显色为+++。

1.3.2 血清细胞因子TNF-α、VCAM-1、IL-4的检测收集两组患者血清4m l，离心10m in取上清液，采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、VCAM-1、IL-4水平。以吸光度A值为Y轴，相应的TNF-α、VCAM-1、IL-4标准品浓度为X轴做标准曲线。样品的TNF-α、VCAM-1、IL-4含量可根据其ID值由标准曲线推断出来。

1.4 统计学方法使用SAS9.0统计分析系统进行数据处理。计量资料以均数±标准差(x-±s)表示，两组间的均数比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

HE染色显示，子痫前期患者胎盘局灶广泛梗死，绒毛纤维素样坏死，合体滋养细胞结节样增生，血管壁增厚等病理变化明显多于正常妊娠者(见图1)。

图1 胎盘HE的染色（苏木素-伊红，×50）

2.1 各组胎盘NF-κB p65、VCAM-1、IκB-α、Bcl-1表达比较子痫前期组较正常妊娠组胎盘NF-κB p65、VCAM-1的表达明显升高，且随着病情加重明显增加(图2、图3)；子痫前期组较正常妊娠组胎盘IκB-α、Bcl-1表达明显降低，且随着病情加重明显降低(图4、图5)。

图2 胎盘NF-κB p65的表达(通用二步法，DAB染色，苏木素复染，×50)

图3 胎盘VCAM-1的表达(通用二步法，DAB染色，苏木素复染，×50)

图4 胎盘IκB-α的表达(通用二步法，DAB染色，苏木素复染，×50)

图5 胎盘Bcl-1的表达(通用二步法，DAB染色，苏木素复染，×50)

2.2 各组患者血清细胞因子TNF-α、VCAM-1、IL-4水平比较子痫前期组患者血清TNF-α、VCAM-1水平明显高于正常妊娠组，且随着病情加重明显升高。子痫前期组患者的血清IL-4水平明显低于正常妊娠组，且随着病情加重明显降低，见表1。

表1 对照组与子痫前期患者血清TNF-α、VCAM-1、IL-4水平变化(±s)

表1 对照组与子痫前期患者血清TNF-α、VCAM-1、IL-4水平变化(±s)

注：轻度子痫前期组、重度子痫前期组与对照组比较，aP＜0.01。

组别对照组轻度子痫前期组重度子痫前期组例数40 40 40 TNF-α(ng/m l) 14.27±1.34 26.53±1.58a51.5±3.23aVCAM-1(µg/ml) 85.14±6.23 119.35±9.80a128.1±13.11aIL-4(µg/ml) 27.01±1.97 13.16±1.52a7.01±1.14a

3 讨论

3.1 子痫前期与免疫、炎症胎盘是母胎界面维持胎儿在宫内营养和生长发育的重要器官。母胎界面免疫细胞包括巨噬细胞、T细胞、NK细胞及蜕膜颗粒细胞等，巨噬细胞在母胎界面非特异性免疫中发挥一定的作用。巨噬细胞被激活后可以分泌TNF-α来限制滋养细胞的浸润能力[3]。子痫前期孕妇胎盘巨噬细胞可诱导滋养细胞凋亡增加，滋养细胞侵入子宫胎盘的螺旋动脉减少，滋养细胞的浸润能力下降可能是子痫前期患者发病的主要原因[4]。IL-1、IL-2、TNF由Th1细胞分泌，表现为免疫侵害；IL-4、IL-10由Th2细胞分泌，表现为免疫防护反应。正常妊娠孕妇中Th2免疫增强，子痫前期孕妇则表现为Th1型占优势。先兆子痫患者中NK细胞、巨噬细胞表达明显提高。巨噬细胞凋亡增加，能使免疫反应减弱。一般情况下，母胎界面蜕膜细胞可减少NK细胞对胎儿的免疫损伤，子痫前期患者滋养细胞侵蚀能力下降，导致蜕膜细胞抑制NK细胞的作用减弱。粘附分子参与滋养细胞形成及分化。滋养细胞侵蚀能力下降，还可能与粘附分子表达障碍有一定关系，随着子痫前期孕妇收缩压升高，血中VCAM-1表达升高，滋养细胞侵蚀能力明显下降[5]。VCAM-1还可使白细胞通过内皮细胞间的连接处进入组织，引起炎性反应，并吸引更多的白细胞到内皮细胞表面，进一步促进白细胞活化与粘附，造成恶性循环[6]。而血管内皮VCAM-1的异常表达可反映内皮细胞的损伤。

3.2 NF-κB与免疫、炎症NF-κB是一种广泛存在于细胞中的蛋白质因子，其具有多向性转录调节作用。典型的NF-κB是由p50和p65亚基形成的异二聚体。在NF-κB家族中p65亚单位是主要的促炎亚单位[7]。目前发现能激活NF-κB的因素至少150种，大约有200多种基因受NF-κB调控。TNF-α、IL-1和NF-κB相互制约，相互影响，两者为正相关。TNF-α、IL-1既是NF-κB的激动剂，又是其靶基因。NF-κB被活化后可诱导IκB表达，IκB进入胞核后NF-κB从DNA上解离，转移到胞质，这样形成负反馈调节[8]。TNF-α是炎症反应的重要启动因子，通过花生四烯酸代谢途径、蛋白激酶途径、氧自由基、一氧化氮(NO)、各种细胞毒性基因转录及核因子调控、ADP核糖基化、DNA片段等多种途径造成心肌损伤[9]。NF-κB的活化与机体的免疫密切相关，NF-κB参与树突状细胞的抗原递呈和T细胞的活化。树突状细胞过度表达IκBα后可抑制NF-κB的活性，引起IL-12、TNF-α的表达下降，而导致免疫耐受。NF-κB是炎症因子基因表达的重要因子之一，被称为前炎症介质转录因子。NF-κB被各种损伤因素激活后可诱导炎症相关因子的基因转录，其中包括细胞因子(IL-1、IL-2、IL-6、IL-12、IFN-β、TNF-α)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、趋化因子(IL-8、补体C3)、转录因子(IκBα、p150、c-Rel、Bcl-3)等。本研究结果发现，子痫前期组较正常妊娠组的胎盘NF-κB p65、VCAM-1表达明显升高，且随着病情加重明显增加；子痫前期组较正常妊娠组的胎盘IκB-α、Bc-1表达明显降低，且随着病情加重明显降低。

3.3 NF-κB与细胞因子NF-κB与胚胎的植入相关。雌激素在转录水平通过诱导IκBα及降低NF-κB活性来抑制CD4+T细胞中IL-2的产生[10]。NF-κB P65活化降低，TNF-α、INF-γ、巨噬细胞炎症因子减少，NF-κB在妊娠期免疫反应中起重要作用[11]。VCAM-1还可使白细胞通过内皮细胞间的连接处进入组织，引起炎性反应，并吸引更多的白细胞到内皮细胞表面，进一步促进白细胞活化与粘附，造成恶性循环[12]。而血管内皮VCAM-1的异常表达可反映内皮细胞的损伤。

NF-κB是ICAM-1的上游基因调控蛋白，它通过细胞间信号转导粘附分子的转录活性，早期即在转录水平调控内皮源性基因ICAM-1的表达[13]。NF-κB是一种广泛存在于细胞中具有多向性转录调节作用的蛋白质因子，它能与多种细胞因子、粘附分子基因启动子部位的位点发生结合，增强这些基因的转录和表达，导致TNF、IL-1、IL-6、IL-8、ICAM-1和P-selectin等基因过度表达，是炎症反应的核心，抑制NF-κB的活性可减少IL-6、TNF-α的产生[14]。

子痫前期滋养细胞的凋亡、NF-κB活性的增加、抗凋亡蛋白bcl-1的减少这三者之间密切相关。比较子痫前期孕妇血浆和正常孕妇血浆培养脐静脉内皮细胞，已发现子痫前期孕妇血浆中过氧化物表达是正常孕妇的4.5倍，子痫前期患者的血浆可使内皮细胞的NF-κB表达提高2.5倍并使细胞表面ICAM-1表达上升，证实了子痫前期孕妇血浆中的过氧化物可能通过活化NF-κB来提高ICAM-1表达，从而导致内皮细胞功能紊乱[15]。子痫前期患者血浆中过氧亚硝酸盐升高后，通过NF-κB诱导血管内皮细胞iNOS表达升高，说明其与内皮细胞损伤呈正相关[10]。TNF-α的水平还与子痫前期发生发展程度有一定相关性，先兆子痫发生时血清TNF-α水平会急剧升高[16-17]。本组资料结果表明，子痫前期组患者血清TNF-α、VCAM-1水平明显高于正常妊娠组，且随着病情加重明显升高。子痫前期组患者血清IL-4水平明显低于正常妊娠组，且随着病情加重明显降低。

综上所述，子痫前期组患者胎盘NF-κB p65、VCAM-1表达与病情加重呈正相关，而IκB-α、Bcl-1的表达则与病情加重呈负相关(P＜0.01)。子痫前期组患者血清细胞因子TNF-α、VCAM-1水平与患者病情加重呈正相关，而IL-4水平则与病情加重呈负相关(P＜0.01)。提示子痫前期患者胎盘NF-κB呈现活化增强，与细胞因子表达密切相关，其参与免疫炎症反应及胎盘细胞损伤，加速子痫前期的发病过程。

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Expression of NF-κBin placenta of preeclampsia and its relationship with changes of cytokines.

CHEN Fang-rong,GONG Hu-ming,RU Mei-yan,SHI Lei,LU Min.Department of Gynaecology and Obstetrics,People's HospitalofHainan Province,Haikou 570311,Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression of nuclear factor-kappa B(NF-κB)in placenta of preeclampsia and its relationship w ith the changes of cytokines.MethodsOne hundred and twenty late pregnant patients in Departmentof Gynaecology and Obstetrics in People's Hospital of Hainan Provincewere recruited:40 normal pregnant women(the control group)and 80 preeclampsia patients(the preeclampsia group,40 with m ild preeclampsia and 40w ith severe preeclampsia).Expression of placenta NF-κB p65,VCAM-1,IκB-αand Bcl-1were determined by immunofluorescence.Serum TNF-α,VCAM-1 and IL-4 levels before delivery were detected by ELISA. The preeclampsia group and the controlgroup were analyzed statistically to determinewhether theResultswere statisti-cally significant.ResultsComparedwith the controlgroup,the levelsof placenta NF-κB p65,VCAM-1 in preeclampsia groupwere significantly elevated,while the levelsof IκB-αand Bcl-1 in preeclampsiagroup were significantly decreased(P＜0.05).The levels of serum TNF-α,VCAM-1 in preeclampsiagroup were significantly higher than those in the control group(P＜0.05),while the level of serum IL-4 wassignificantly decreased(P＜0.05).ConclusionThe placenta NF-κB of preeclam psia is activated and enhanced,closely related w ith the expression of cytokines,w hich involved in the immune inflammatory reaction and placental cell injury,and accelerates the pathogenesisof preeclampsia.

Preeclampsia;Nuclear factor-kappa B(NF-κB);Cytokines;Inflammatory

R714.24+5

A

1003—6350（2014）04—0483—04

2013-09-02)

海南省自然科学基金资助项目（编号：30636）

龚护民。E-mail：13337610058@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.04.0187