hCTR1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

阳 甜，李 洋，陈天君，高 雷，陈明伟

(西安交通大学医学院第一附属医院呼吸内科，陕西西安 710061)

hCTR1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

阳 甜，李 洋，陈天君，高 雷，陈明伟

(西安交通大学医学院第一附属医院呼吸内科，陕西西安 710061)

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织中hCTR1的表达与患者临床病理特征的关系以及减轻铂类药副反应的临床方法。方法采用免疫组织化学法，检测54例手术后接受含顺铂方案一线化疗的NSCLC患者组织中hCTR1的表达情况，其中35例患者于化疗前后采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施，分析hCTR1表达与NSCLC患者临床特征、病理类型、分化程度、临床分期、化疗疗效及化疗副反应的关系。结果hCTR1的免疫阳性反应主要定位于NSCLC细胞的细胞质；hCTR1表达与含顺铂方案的化疗疗效及淋巴结转移呈正相关(P=0.02，P= 0.01)，而与年龄(P=0.29)、性别(P=0.32)、病理类型(P=0.19)、临床分期(P=0.52)、分化程度(P=0.62)及是否吸烟(P=0.89)无关；化疗副反应大小与性别(P=0.87)及年龄(P=0.47)无关，与在化疗前后是否采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施有关(P＜0.05)。结论hCTR1的表达可能是NSCLC患者以铂类为基础治疗的化疗疗效及淋巴结转移的重要预测因子。对于有高表达hCTR1的NSCLC患者化疗时，在化疗前后采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施，可以减轻化疗副反应。

非小细胞肺癌；铜离子转运蛋白1(hCTR1)；顺铂；化疗副反应

据美国国家癌症研究所报道肿瘤发生率及死亡率较前有所下降，但肺癌仍然是目前最常见的恶性肿瘤之一［1］。虽然随着科技的发展及对肺癌的更多认识，但是患者平均生存期仍然不容乐观，早期诊断及治疗仍然是全世界攻克的难题。铂类药作为一线化疗药，已被广泛用于治疗各种恶性肿瘤［2］，但继发耐药的发生，使肺癌患者生存期并没有明显提高。近年的研究发现，铜离子转运蛋白家族参与铂类抗肿瘤药物出胞和入胞的调节，摄入减少和泵出过多，均可减少药物在细胞内的聚积，导致耐药。铜离子转运蛋白1(human copper transporters 1，hCTR1)是铜离子转运蛋白家族成员，是主要的铜离子摄入蛋白，研究证实其参与铂类抗肿瘤药物的摄入［3］。已有研究发现晚期肺癌患者h CTR1表达与预后有关［4］。本研究通过免疫组化及生存分析方法，研究h CTR1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达，以寻求减轻铂类耐药的副反应，减轻患者痛苦并指导临床。

1 材料与方法

1.1 研究对象及治疗所有标本均来自2005年1月～2009年12月西安交通大学医学院病理科的石蜡包埋标本54例，经病理确诊为肺癌，全部为初次经过手术，术后进行2周期以铂类药为基础治疗的化疗，两周期之间，间隔时间为3周，期间未进行放疗。其中35例患者于化疗前后采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施减轻副反应，另外19例患者化疗前及出现明显副反应前未进行上述治疗。化疗方法为一线铂类药，铂类药剂量75～80 mg/m2。每周期化疗结束，复查胸部CT、头颅MRI、骨扫描及上腹部CT。按照RECIST标准进行化疗疗效评估。按照抗癌药急性及亚急性毒性反应分度标准(WHO标准)评估副作用大小。

1.2 免疫组化SP方法检测hCTR1及结果判定标准hCTR1购于美国Novus公司。符合条件的石蜡包埋切片54张，连续切片4张，4μm厚，60℃恒温箱烤片过夜，脱蜡。消除内源性过氧化物酶。EDTA热修复自然冷却至室温后取出切片。PBS洗，3 min 3次，滴加一抗hCTR1(Novus 1∶250)，37℃放置2 h过夜。甩掉一抗，PBS洗，3 min 3次，擦干周围液体，滴加二抗，室温孵育30 min。甩掉二抗，PBS洗，3 min 3次，滴加DAB染液显色，显微镜下控制显色时间。自来水冲洗后，苏木精复染，自来水冲洗。梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察。

结果判定：按照HAO等［5］推荐的方法观察h CTR1在NSCLC中的表达情况。评分采用染色强度及阳性细胞数百分比综合评价。染色强度评分：0分，无染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。计数每个组织的3个10×40倍视野下肿瘤细胞的阳性细胞数，阳性细胞数百分比=(阳性表达的肿瘤细胞数/所有肿瘤细胞数)×100%。评分：0分＜10%；1分，10%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～74%；4分，＞75%。两类所得评分的乘积为最终结果：4～12分为高表达；小于4分为低表达。判读标准：所有载玻片结果均由2名病理医师在双盲情况下对免疫组化染色进行独立阅片评估。

1.3 统计方法SPSS 16.0软件进行数据处理。采用卡方检验比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 hCTR1在NSCLC中的表达hCTR1阳性染色主要位于癌细胞胞质，阳性产物呈棕黄色弥漫分布，在NSCLC中的表达强度及范围如图1所示。

图1 hCTR1在NSCLC中的表达强度及范围Fig.1 Intensity and range of hCTR1 expression in non-small cell lung cancer(×200)

2.2 hCTR1表达与NSCLC临床及病理的关系hCTR1的表达54例中阳性表达率为59.2%。表达与年龄(P=0.29)、是否吸烟(P=0.89)、性别(P=0.32)、分期(P=0.52)及分化程度(P=0.62)无相关性，无统计学意义；而与术后化疗疗效(P= 0.02)及是否淋巴结转移(P=0.01)有关，有统计学意义，推测hCTR1表达越高，疗效越好、淋巴结转移越少(表1)。

表1 hCTR1表达与肺癌患者临床病理特征之间的关系Tab.1 Association between 1 hCTR1 expression and clinicopathological data of NSCLC patients

2.3 手术后的化疗副反应观察结果本研究中共54例，初次手术后进行以顺铂为基础的一线化疗，观察化疗副反应发生情况，其中消化道反应，如胃肠道不适、恶心、呕吐，腹泻，有33人，占62.2%；血液毒性反应，如白细胞下降，血小板减低，有4人，占7.5%；未发生神经毒性反应。副反应大小按抗癌药急性及亚急性毒性反应分度标准(WHO标准)［6］评估，副反应大小与性别(P=0.87)及年龄(P=0.47)无明显相关性，而与是否在化疗前后采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施有关(P＜0.05)，而且应用这些措施后副反应较未用时明显减小(表2)。

表2 化疗药物副作用大小与肺癌患者临床病理特征之间的关系Tab.2 Association between side effects of chemotherapy and clinicopathological data of NSCLC patients

3 讨 论

铜离子转运蛋白家族包括hCTR1和铜离子转运磷酸化ATP酶(copper transporting phosphorylated ATPase，ATP7A和ATP7B)。hCTR1是主要的铜离子摄入蛋白，研究证实参与铂类抗肿瘤药物的摄入［6］。人类CTR1蛋白位于9q31/32［7］，主要分布于细胞膜，由190个氨基酸组成，含有3个跨膜区，其中富含蛋氨酸和组氨酸的氨基端为结合铜离子所必需［8-9］。CTR1可以形成寡聚体复合物利于铜离子摄人，寡聚体复合物的形成受温度、p H、K+浓度以及胞外铜离子浓度的影响［10］。

顺铂耐药是一个多方面、多因素作用的结果，有研究证实铂类耐药的决定因素与铂类药的转运、解毒、DNA损伤、DDR以及凋亡蛋白等有关。许多对顺铂耐药的细胞，表现出对顺铂的摄入能力下降，具体原因还有待进一步研究。尽管CTR1能够介导顺铂的摄入，但是否由于hCTR1的本身表达缺失还是由于其功能缺陷，或由于人肿瘤组织中h CTR1的表达不同导致肿瘤对顺铂的药物的敏感性，还不完全清楚。有研究报道，hCTR1的表达与以铂类药为基础治疗的肿瘤患者的疗效及预后有相关性。CHEN等［4］采用免疫组化方法，研究发现54例初次接受铂类化疗的晚期NSCLC患者中hCTR1高表达的化疗反应效果越好，PFS(中位进展生存期)及OS(总生存期)越好，提示h CTR1不仅是一种独立的铂类化疗的预测因子，也是一种很好的预后因子。同时，LEE等［11］采用RT-PCR检测了40例卵巢癌患者中CTR1和CTR2的表达水平，研究表明，hCTR1的高表达是对铂类药高敏感和高生存率预后的预测因子之一，而CTR2的高表达与CTR1的低表达的卵巢癌患者，对铂类药更耐药和生存期更短。

本研究采用免疫组化方法检测手术后NSCLC标本中h CTR1表达情况，评估hCTR1与术后患者进行2周期方案化疗后在淋巴结转移、化疗疗效等方面的关系，结果表明h CTR1表达在NSCLC组织中主要分布于癌细胞胞质，h CTR1表达与化疗疗效(P=0.02)及淋巴结转移(P=0.01)方面相关性具有统计学意义，而与患者年龄、性别、是否吸烟、病理类型、分化程度及临床分期无统计学意义。提示hCTR1表达可以作为NSCLC患者化疗疗效的判断标准之一，这与CHEN等报道的一致。h CTR1表达越高，疗效越好，因此提高肺癌的hCTR1表达水平，可以增加肺癌细胞对抗肿瘤细胞的敏感性，增加化疗疗效。在淋巴结转移方面h CTR1在37例转移患者中阳性表达率仅为18.9%，低表达hCTR1患者淋巴结无转移，而两者具有统计学意义。

铂类药被广泛用于各种肿瘤化疗，但其化疗副反应如耳毒性、外周神经病变、体重减轻、恶心、呕吐、肾毒性、癫痫发作、听力损失和耳鸣等以及铂类药物的耐药严重，影响了其化疗疗效［12］。西方国家患者对顺铂的副反应大多为周围神经病变［13］，而我国大多为消化道副反应和骨髓的抑制。原因可能为种族的不同、化疗剂量、化疗方案及与化疗前后采取的措施等有关。本研究观察发现在化疗前后是否采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施，化疗毒性反应的分度上具有统计学意义，副反应较未用水化及还原型谷胱甘肽等措施者明显减小，而与年龄及性别关系不大。有研究发现，hCTR1的合成与谷胱甘肽含量有关［14］，因此增加谷胱甘肽含量可以增加肿瘤细胞对铂类药的敏感性［15］，同时减少了顺铂的副反应，包括神经毒性及消化道毒性。国外有研究报道通过姜黄素降低其神经毒性［16］。

因此，临床上可以通过检测hCTR1的表达，预测NSCLC患者对以铂类为基础治疗的化疗疗效及淋巴结转移情况，h CTR1表达越高，疗效越好、淋巴结转移越少；同时对于存在有高表达的hCTR1肺癌术后患者进行化疗时，可以在化疗前后采取水化、还原型谷胱甘肽、维生素B2及姜黄素等措施，可以减轻化疗副反应，提高化疗疗效并减轻患者痛苦。本实验为回顾性病例对照研究，因而可能存在选择误差，同时，由于样本量所限，故研究结果还有待今后进一步加大样本量来验证。

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(编辑 国 荣)

Expression and clinical significance of hCTR1 in non-small cell lung cancer

YANG Tian，LI Yang，CHEN Tian-jun，GAO Lei，CHEN Ming-wei
(Respiratory Department，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061，China)

ObjectiveTo investigate the expression of human copper transporters 1(h CTR1)in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)and analyze its correlation with the clinicopathologic features andMethodsto reduce the clinical side effects of platinum drugs.MethodsIn the specimens of 54 lung cancer surgical patients treated with first-line cisplatin-based chemotherapy，the expression of h CTR1 protein was determined with immunohistochemistry.Then we analyzed its correlation with NSCLC clinical features，histological type，degree of differentiation，clinical stage，chemotherapy and side effects of chemotherapy.ResultsThe positive immune reaction of hCTR1 was observed mainly in cytoplasmic staining of NSCLC cells.The expression of hCTR1 had positive correlation with the response to cisplatin-based chemotherapy and lymph node metastasis(P=0.02 and 0.01，respectively).There was no significant correlation between h CTR1 expression and the following factors：age (P=0.29)，sex(P=0.32)，histological type(P=0.19)，clinical stage(P=0.52)，differentiation(P=0.62)and smoking(P=0.89).The side effects of chemotherapy was not related to age(P=0.47)and sex(P=0.87). However，h CTR1 expression was significantly related to receiving hydration，reduced glutathione，vitamin B2 and curcumin before and after chemotherapy(P＜0.05).ConclusionThe expression level of hCTR1 is an important factor that predicts the response to platinum-based chemotherapy and lymph node metastasis in NSCLC patients.For NSCLC patients with high h CTR1 expression，receiving hydration，reduced glutathione，vitamin B2 and curcumin before and after chemotherapy may reduce the side effects of chemotherapy.

non-small cell lung cancer(NSCLC)；human copper transporters 1(hCTR1)；cisplatin；side effects of chemotherapy

R734.2

A

1671-8259(2014)05-0651-04

10.7652/jdyxb201405016

2013-12-04

2014-04-16

陕西省科技攻关项目(No.2011K12-15) Supported by the Science and Technology Research Projects of Shaanxi Province(No.2011K12-15)

陈明伟，教授.E-mail：chenmingwei@mail.xjtu.edu.cn

阳甜(1983-)，女(汉族)，在读博士生.研究方向：肺癌的基础与临床.E-mail：xiaojunjun0829@126.com

时间：2014-07-22 16∶20 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1620.006.html