苦参碱可抑制Th17所诱导的角质形成细胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达

周 艳，牟宽厚，韩 丹，李 玥，侯卫坤，马亚梅，吕社民

(西安交通大学医学院：1.第一附属医院皮肤科，2.遗传学与分子生物学系，陕西西安 710061；3.西安市红会医院关节外科，陕西西安 710054)

苦参碱可抑制Th17所诱导的角质形成细胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达

周 艳1，牟宽厚1，韩 丹1，李 玥2，侯卫坤3，马亚梅1，吕社民2

(西安交通大学医学院：1.第一附属医院皮肤科，2.遗传学与分子生物学系，陕西西安 710061；3.西安市红会医院关节外科，陕西西安 710054)

目的考察苦参碱(matrine，Mat)对Th17诱导的角质形成细胞(keratinocytes，KC)系HaCa T细胞白细胞介素-17受体A(IL-17RA)、白细胞介素-21受体(IL-21R)及白细胞介素-22受体1(IL-22R1)表达的影响。方法培养HaCaT细胞，用Th17分泌的主要效应因子IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22(10 ng/m L)联合刺激HaCaT细胞模拟类银屑病样细胞模型，再用10μg/mL及100μg/mL的Mat干预此细胞模型，采用RT-qPCR及Western blot方法检测IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达变化。结果IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA及蛋白在HaCaT细胞上有表达。IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激可以显著促进HaCaT细胞IL-17RA、IL-21R m RNA及蛋白表达，IL-22R1蛋白的表达量升高(P＜0.05)。Mat单独干预或与上述细胞因子联合干预组与未处理的HaCaT细胞组相比，IL-17RA、IL-21R及IL-22R1表达无显著下降(P＞0.05)，但可以显著降低IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激后所升高的受体蛋白表达(P＜0.05)。结论IL-17A、IL-21及IL-22联合刺激角质形成细胞可以增强IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的表达，Mat可抑制这种增强作用，可能在多种Th17介导的免疫性皮肤病中发挥抗炎作用。

苦参碱；Th17细胞因子；白介素-17受体A；白介素-21受体；白介素-22受体1

角质形成细胞(keratinocytes，KC)是许多皮肤病中参与炎症反应和皮肤免疫的重要免疫细胞［1］。HaCaT细胞株具有与正常KC相似的分化特征，在体外容易培养，可作为体外研究药物及皮肤病的良好模型［2］。近年来，Th17作为Th细胞的新亚型，参与银屑病、接触性皮炎、特应性皮炎等许多皮肤病的免疫发病机制［3］。Th17细胞主要产生IL-17A、IL-21和IL-22等，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1分别为IL-17A、IL-21和IL-22的主要受体［4-6］。Th17作用于皮肤需要通过激活上述受体而发挥其作用。苦参碱(matrine，Mat)对多种自身免疫性疾病具有抗炎作用［7］，也可用于炎症性皮肤疾病的治疗，但其作用机制复杂，尤其是其抑炎机制是否与Th17相关尚不清楚。因此，本实验从Mat对Th17所产生因子的受体影响着手，选择其作用于皮肤的角质形成细胞作为研究靶点，以期为Mat治疗银屑病等多种皮肤病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂人永生化角质形成细胞(HaCa T细胞)由第四军医大学皮肤科实验室馈赠，本实验室保存。RPMI-1640细胞培养基(Hyclone，美国)，胰蛋白酶及EDTA(杭州四季青公司)。Trizol法总RNA抽提试剂盒(Invitrogen，美国)；用于RT-qPCR的IL-17RA、IL-21R及IL-22R1引物(北京奥克公司)；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，日本)；5-Target qPCR Kit(Bio-Rad，美国)；cDNA试剂盒(Fermentas，加拿大)。

Mat注射液(江苏连云港正大天晴医药有限公司)，临用时用生理盐水稀释成10、100μg/m L作为实验浓度。细胞因子IL-17A、IL-21及IL-22均购自Peprotech公司(美国)。根据预实验结果将10 ng/mL作为实验浓度。鼠单克隆IL-17RA抗体购自R&D Systems公司(美国)，兔多克隆IL-21R抗体和兔多克隆IL-22R1抗体购自Abcam公司(英国)，GAPDH购自Santa Cruz公司(美国)。

1.2 角质形成细胞的培养HaCa T细胞用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培养基(含100 U/m L青霉素，100 U/m L链霉素)，于37℃、50 m L/L CO2恒温培养箱中培养，当细胞达到80%融合时，用2.5 g/L胰蛋白酶+0.5 g/L EDTA 37℃进行消化传代。

1.3 细胞因子及药物干预以细胞密度1×105个/mL接种于24孔培养板，置恒温培养箱中培养，待细胞平稳生长至70%～80%融合后，换成无血清的RPMI-1640培养基，分别加入Mat(10、100μg/m L)、IL-17、IL-21、IL-22、IL-17+IL-21、IL-17+IL-22、IL-21+ IL-22、IL-17+IL-21+IL-22以及IL-17+IL-21+IL-22+Mat(100μg/m L)进行分组培养，培养时间为24 h。每组平行设3个复孔，对照组为不加药物的无血清的RPMI-1640培养基。24 h后将各组细胞分别离心，收取沉淀的细胞。

1.4 用RT-qPCR法检测IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的mRNA表达将上述细胞加入1 m L Trizol抽打匀浆；按照标准抽提步骤进行RNA抽提；将样品逆转录为cDNA，建立RT-qPCR反应体系；反应条件为：95℃预变性10 min，95℃变性5 s、退火30 s、72℃延伸15 s，共40个循环。IL-17RA、IL-21R及IL-22R1引物及内参β-actin引物(北京奥克公司)见表1。应用SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ荧光染料技术进行实时定量PCR反应，计算机分析Ct值，用以评定各因子m RNA的表达水平。

表1 RT-qPCR引物信息Tab.1 Information of primers for RT-qPCR

1.5 Western blot法检测IL-17RA、IL-21R及IL-22R1的蛋白表达采用改良型RIPA细胞裂解液，即50 mmol/L Tris-HCl，p H 7.4，150 mmol/L NaCl，10 m L/L Triton X-100，0.2 mmol/L EDTA，10 g/L脱氧胆酸钠，1 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)，加蛋白酶抑制剂(Beyotime，中国)，然后离心5 min。BCA方法测定细胞总蛋白浓度，按常规方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，转膜并封闭后，分别加入鼠单克隆IL-17RA抗体(稀释成1∶1 000)，兔多克隆IL-21R抗体(1∶1 000)和兔多克隆IL-22R1抗体(1∶1 000)1 m L，4℃过夜。再加入HRP标记的抗小鼠或抗兔的二抗(1∶1 000)1 m L，室温孵育1 h，洗膜、显影，置UVP成像系统中摄影，分析目的基因与内参基因GAPDH的条带灰度值。

1.6 统计学分析实验数据采用SPSS 16.0统计软件进行处理，实验重复3次，采用方差分析及t检验进行比较，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 IL-17A、IL-21及IL-22单独及联合干预HaCaT细胞时其受体mRNA的表达变化IL-17RA、IL-21R及IL-22R1 mRNA在HaCaT细胞上有明显表达。IL-17A、IL-21及IL-22单独、2因子以及3因子联合作用HaCaT细胞时，各处理组其靶向受体mRNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05)，IL-17A和IL-21单独及3因子联合作用均可诱导其靶向受体表达增高，与正常对照比较，差异有统计学意义(P＜0.05，图1)。

图1 Th17细胞因子单独及联合干预HaCaT细胞时对其靶向受体mRNA表达的影响Fig.1 Effects of Th17 cytokines treatment alone or in combination on the m RNA expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells

2.2 Mat对HaCaT细胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1 mRNA表达的影响10、100μg/m L的Mat刺激HaCa T细胞24 h后，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1与正常对照组相比，m RNA的表达差异无统计学意义(P＞0.05，图2)。

IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22 (10 ng/m L)联合刺激可使IL-17RA mRNA的表达量上调95.25%，IL-21R mRNA的表达量上调171.2%，与对照组相比有统计学意义(P＜0.01)；可使IL-22R1 mRNA的表达量上调55.98%，但差异无统计学意义(P＞0.05)。Mat(10μg/mL)及Mat(100μg/mL)分别可以使经上述细胞因子联合刺激后所上调的IL-17RA mRNA显著下降120.5%及144.6%(P＜0.01)；IL-21R mRNA显著下降238.9%及242%(P＜0.01)；IL-22R1 mRNA显著下降了108.6%及90.03%(P＜0.05)，差异均有统计学意义。Mat(100μg/m L)与Th17分泌的3种细胞因子(10 ng/mL)联合干预后，仍可使经细胞因子刺激后所上调IL-17RA m RNA的表达下调77.27%(P＜0.05)，IL-21R m RNA的表达下调146.7%(P＜0.01)，差异有统计学意义；IL-22R1 mRNA的表达下调无统计学意义(P＞0.05，图2)。

图2 Mat对Th17细胞因子干预后HaCaT细胞表达IL-17RA、IL-21R及IL-22R1 mRNA的影响Fig.2 Effects of Mat on the mRNA expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells treated with Th17 cytokines

2.3 Mat对HaCaT细胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1蛋白表达的影响Western blot检测结果表明，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1蛋白在HaCaT细胞表面亦呈阳性表达(图3A)。10、100μg/mL的Mat分别刺激HaCa T细胞24 h后，IL-17RA、IL-21R和IL-22R1的蛋白表达较正常对照组有不同程度的降低，但差异均无统计学意义(P＞0.05，图3B)。

图3 Western blot检测Mat对Th17细胞因子干预后HaCaT细胞IL-17RA、IL-21R及IL-22R1蛋白表达的影响Fig.3 Effects of Mat on the protein expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 in HaCa T cells treated with Th17 cytokines analyzed by Western blot

IL-17A(10 ng/m L)、IL-21(10 ng/m L)及IL-22 (10 ng/m L)联合刺激可使IL-17RA蛋白的表达上调178.7%(P＜0.001)，IL-21R蛋白上调183.1%(P＜0.01)，IL-22R1蛋白上调127.1%(P＜0.05)，与对照组比较差异有统计学意义。Mat(10μg/m L)及Mat(100μg/m L)分别可以使经上述细胞因子刺激后所上调的IL-17RA蛋白显著下降了191.5%(P＜ 0.01)及255%(P＜0.001)，且呈量效关系；IL-21R蛋白显著下降242.9%(P＜0.01)及254.7%(P＜0.01)；IL-22R1蛋白显著下降184.1%(P＜0.05)及193.1%(P＜0.05)；而Mat(100μg/m L)与Th17分泌的3种细胞因子联合孵育后，仍可使经Th17细胞因子刺激后所上调IL-17RA蛋白的表达下调185.8% (P＜0.01)；IL-21R蛋白的表达下调175.3%(P＜0.01)；IL-22R1蛋白的表达下调105.5%(P＜0.05，图3)。

3 讨 论

Mat是中药苦参的主要生物碱，具有广泛的药理作用。临床上Mat可用来治疗银屑病等慢性炎症性皮肤疾病［8］，但其作用机制尚不清楚。近年来，多位学者已证实银屑病为Th1和Th17所介导的免疫性疾病［9］。我们以前的实验也发现IL-17A、IL-21及IL-22及其受体在银屑病的表皮细胞高表达。银屑病的组织病理显示KC角化过度及角化不全。KC细胞为银屑病最重要的病变细胞。因此，我们通过用Th17分泌的细胞因子IL-17A、IL-21及IL-22单独及2因子和3因子联合干预HaCat细胞，发现其靶受体的m RNA表达无显著差异。因此，我们认为Th17效应因子对自身受体存在较强的激活作用，与其他Th17分泌因子联合作用不能加强或减弱其对自身受体的激活效应。因此，我们将Th17最主要的3个效应因子联合刺激HaCat作为类银屑病样细胞模型，并应用Mat进行药物干预，观察其作用机制。

本实验首先发现，IL-17A、IL-21及IL-22作为Th17最具代表性的因子，可以正向调节角质形成细胞IL-17RA、IL-21R的基因和蛋白表达增加，同时促进IL-22R1蛋白升高。这可能与炎症因子正反馈地调节其受体的表达有关。以往研究表明，IL-17A作为很强的中性粒及单核细胞趋化因子，可能在银屑病中通过和其受体IL-17RA结合，起到很强的促炎作用［10］。IL-21可以促进T细胞向Th17分化，Th17又可以分泌IL-21，从而起到正反馈作用［11］。在银屑病小鼠模型，IL-21通过IL-21R作用可诱发IFN-γ-依赖性银屑病样反应，从而证实IL-21维持皮肤炎症损伤的一种机制［12］。而IL-22则与其受体IL-22R1结合，发挥其促炎及表皮增生作用［13］。这些均证实3种细胞因子联合作用可以从不同机制相互促进银屑病发生。

在Mat单独及联合细胞因子干预时，结果发现Mat单独刺激可以抑制HaCat细胞上述细胞因子受体的表达，但与正常对照相比，差异无统计学意义，提示Mat对正常角质形成细胞的抗Th17作用不明显。但是与Th17细胞因子刺激组相比，IL-17RA及IL-21R明显被抑制，而对IL-22R1抑制作用较弱。而Mat与Th17细胞因子联合干预则会削弱这一作用。提示Mat在抑制Th17反应中，对IL-17及IL-21所诱导的抗炎功能更强大，而抑制角质形成细胞IL-22所介导的增殖及促炎功能较小。ZHAO等［14］研究发现Mat可抑制自身免疫性脑脊髓炎动物模型IL-23/ IL-17轴，从而改善其症状。这与本实验结果一致。因此，推测Mat治疗银屑病等皮肤病可通过抑制Th17而发挥功效。

Th17所介导的皮肤病发生机制非常复杂，多种组织细胞及炎症介质参与其中。本实验从角质形成细胞的角度，首次探讨了Mat对Th17诱导的人KC株HaCaT细胞IL-17RA、IL-21R和IL-22R1的抑制作用。并推测Mat在Th17所诱导的银屑病等皮肤病中可能直接作用于其抗炎靶点细胞角质形成细胞，抑制其分泌的Th17细胞因子受体，从而发挥其治疗作用。

［1］GUTOWSKA-OWSIAK D，OGG GS.The epidermis as an adjuvant［J］.J Invest Dermatol，2012，132(3 Pt 2)：940-948.

［2］CHO KA，SUH JW，LEE KH，et al.IL-17 and IL-22 enhance skin inflammation by stimulating the secretion of IL-1βby keratinocytes via the ROS-NLRP3-caspase-1 pathway［J］.Int Immunol，2012，24(3)：147-158.

［3］CHIRICOZZI A，ZHANG S，DATTOLA A，et al.Role of Th17 in the pathogenesis of cutaneous inflammatory diseases［J］.J Biol Regul Homeost Agents，2012，26(3)：313-318.

［4］WRIGHT JF，BENNETT F，LI B，et al.The human IL-17F/ IL-17A heterodimeric cytokine Signals through the IL-17RA/ IL-17RC receptor complex［J］.J Immunol，2008，181(4)：2799-2805.

［5］PARRISH-NOVAK J，FOSTER DC，HOLLY RD，et al.Interleukin-21 and the IL-21 receptor：Novel effectors of NK and T cell responses［J］.J Leukoc Biol，2002，72(5)：856-863.

［6］JONES BC，LOGSDON NJ，WALTER MR.Structure of IL-22 bound to its high-affinity IL-22R1chain［J］.Structure，2008，16(9)：1333-1344.

［7］KAN QC，ZHU L，LIU N，et al.Matrine suppresses expression of adhesion molecules and chemokines as a mechanism underlying its therapeutic effect in CNS autoimmunity［J］.Immunol Res，2013，56(1)：189-196.

［8］牟宽厚，马慧群.阿维A联合苦参素治疗寻常性银屑病的临床疗效观察［J］.中国皮肤性病学杂志，2010，24(3)：292-294.

［9］LOWES MA，KIKUCHI T，FUENTES-DUCULAN J，et al. Psoriasis vulgaris lesions contain discrete populations of Th1 and Th17 T cells［J］.J Invest Dermatol，2008，128(5)：1207-1211.

［10］WOLK K，HAUGEN HS，XU W，et al.IL-22 and IL-20 are key mediators of the epidermal alterations in psoriasis while IL-17 and IFN-gamma are not［J］.J Mol Med(Berl)，2009，87 (5)：523-536.

［11］KORN T，BETTELLI E，GAO W，et al.IL-21 initiates an alternative pathway to induce proinflammatory T(H)17 cells［J］. Nature，2007，448(7152)：484-487.

［12］SARRA M，CARUSO R，CUPI ML，et al.IL-21 promotes skin recruitment of CD4(+)cells and drives IFN-γ-dependent epidermal hyperplasia［J］.J Immunol，2011，186(9)：5435-5442.

［13］ZHENG Y，DANILENKO DM，VALDEZ P，et al.Interleukin-22，a T(H)17 cytokine，mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis［J］.Nature，2007，45(7128)：648-651.

［14］ZHAO X，KAN Q，ZHU L，et al.Matrine suppresses production of IL-23/IL-17 and ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Am J Chin Med，2011，39(5)：933-941.

(编辑 国 荣)

Matrine inhibits Th17 cytokine-induced IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 expressions of keratinocytes

ZHOU Yan1，MOU Kuan-hou1，HAN Dan1，LI Yue2，HOU Wei-kun3，Ma Ya-mei1，LÜShe-min2
(1.Department of Dermatology，the First Affiliated Hospital，Medical School of Xi'an Jiaotong University，2.Department of Genetics and Molecular Biology，Medical School of Xi'an Jiaotong University，Xi'an 710061；3.Department of Bone and Joint Diseases，Xi'an Honghui Hospital，Xi'an 710054，China)

ObjectiveTo investigate the effects of matrine(Mat)on the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 induced by Th17 cytokines in HaCaT of keratinocytes.MethodsWe cultured HaCaT cells and stimulated HaCaT cells with Th17 effector cytokines IL-17A(10 ng/m L)，IL-21(10 ng/m L)and IL-22(10 ng/m L) together to simulate psoriasis-like cell model.The cell model was treated with 10μg/m L and 100μg/m L Mat.RT-qPCR and Western blot were applied to detect the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1.MethodsIL-17RA，IL-21R and IL-22R1 were expressed in HaCaT cells at both m RNA and protein levels.HaCaT cells triggered by IL-17A，IL-21 and IL-22 together could significantly enhance the m RNA and protein expressions of IL-17RA and IL-21R as well as the protein expression of IL-22R1(P＜0.05).Mat treatment on the cells without Th17 cytokine stimulation did not affect IL-17RA，IL-2 1 R or IL-2 2 R 1 expression(P＞0.05)，but Mat treatment to the cellsseparately or with Th17 cytokine stimulation together can significantly inhibit IL-17RA，IL-21R and IL-22R1 protein expressions compared with Th17 cytokine stimulation group(P＜0.05).ConclusionStimulation of HaCaT cells with IL-17A，IL-21 and IL-22 can enhance the expressions of IL-17RA，IL-21R and IL-22R1.Mat seems to play an anti-inflammatory role through abrogating the stimulatory effects of Th17 cytokines on their receptor expressions in autoimmune skin disease.

matrine；Th17 cytokine；interleukin-17 receptor A；interleukin-21 receptor；interleukin-22 receptor 1

R751

A

1671-8259(2014)05-0695-05

10.7652/jdyxb201405026

2014-04-28

2014-06-12

陕西省社会发展攻关计划项目(No.2010K16-04)；国家自然科学基金资助项目(No.81201373) Supported by the Social Development Research Project of Shaanxi Province(No.2010K16-04)and the National Natural Science Foundation of China(No.81201373)

吕社民，教授，博士生导师.E-mail：lushemin@mail.xjtu.edu.cn

周艳(1977-)，女(汉族)，主治医师，博士研究生，主要从事免疫相关皮肤病研究.E-mail：yanzhou7798@163.com

时间：2014-07-22 16∶28 网络出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20140722.1628.009.html