鹅MYL1基因的克隆及胚胎期表达特征分析

顾志良，邵 芳，石亦静，吴小娟

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

动物的产肉力与肌纤维细胞的数量和生长密切相关[1]，肌纤维是构成骨骼肌的基本单位，肌球蛋白是肌纤维的主要成分之一，是一种多功能马达蛋白，为肌肉收缩提供动力.肌球蛋白是一个超家族，有2条肌球蛋白重链（Myosin heavy chain，MHC）和2条肌球蛋白轻链（Myosin light chian，MYL）组成.哺乳动物存在两对轻链，每对轻链由必需肌球蛋白轻链（Essential myosin light chain，ELC）和调节肌球蛋白轻链（Regula⁃tory myosin light chain，RLC）组成[2]，不同的ELC和RLC的家族成员由多种基因编码，而且同型异构体可呈现不同的表达谱.肌球蛋白轻链、肌钙蛋白C与钙调蛋白同属于EF-hand超家族成员，EF-hand是一种由40个左右氨基酸组成的螺旋-环-螺旋基序（Motif），环区通常是该类蛋白的Ca2+结合区域.肌球蛋白轻链能稳定肌球蛋白的α-螺旋的颈部区域，并位于靠近肌球蛋白三磷酸腺苷结合和肌动蛋白结合结构域[3].

肌球蛋白轻链1基因（myosin light chian1，MYL1）属于ELC的一个成员，编码肌球蛋白必须轻链亚基，主要在哺乳动物的心肌、平滑肌和快肌表达.哺乳动物中，MYL1基因有MLC1f和MLC3f两种异构体，两者之间的不同仅在于N-端的41个氨基酸[4-6].MLC1f和MLC3f的转录调控受到一系列调控元件控制，包括MLC1f和MLC3f的启动子元件和MEF2、MEF3等肌肉组织特异增强子元件[5，7-8].

鹅作为重要水禽，鹅肉具有营养丰富、脂肪含量低、不饱和脂肪酸含量高等优点[9]，其产肉量和肌肉品质都是重要的经济性状，关于鹅肌肉生长发育和肉质形成的研究也备受人们关注.MYL1基因在肌肉生长发育过程中发挥了至关重要的作用.然而鹅MYL1基因至今尚未被克隆和测序，鉴于该基因在肌肉发育过程中的重要意义，本研究将以太湖鹅为材料，采用3′-RACE和5′-RACE技术克隆鹅MYL1基因，对该基因序列作生物信息学分析，并运用实时荧光定量PCR检测MYL1基因在胚胎期的表达情况，旨在为该基因的功能和开展产肉性状分子遗传基础研究积累素材.

1 材料与方法

1.1 试验动物与样品采集

从常熟市江南畜禽食品公司孵化场采集E7、E10、E14、E15、E18、E21、E25和E28的太湖鹅胚各4枚，液氮速冻各组织后于-80℃保存.

1.2 总RNA的提取

用Trizol（Invitrogen，USA）分别提取E7，E10胚胎总RNA及E14、E15、E18、E21、E25和E28鹅胚腿肌总RNA，RNase-free dH2O充分溶解，甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量，NanoDrop2000分光光度计测定其浓度，于-80℃保存备用.

1.3 引物设计及合成

根据GenBank已发表的鸡（登录号：NM_001044632）和鸭（登录号：HQ728349）MYL1基因序列设计鹅CDS区PCR引物.根据RT-PCR获得的序列设计5′-RACE和3′-RACE的特异性引物（包括Outer PCR引物和Inner PCR引物），同时根据克隆获得的MYL1基因cDNA序列设计荧光定量PCR引物，内参用GAPDH，两对引物均跨越内含子，引物均由上海生工生物工程有限公司合成.引物的相关信息见表1.

表1 PCR引物的信息

1.4 鹅MYL1基因5′和3′端的序列扩增及产物的克隆与测序

5′端序列扩增按 TaKaRa 5′-Full RACE Kit说明步骤，对鹅总 RNA（2 μg）进行去磷酸化处理、“去帽子”反应、5′RACE Adaptor连接得到ligated RNA，取6 μL ligated RNA进行反转录反应，最后再分别用MYL3-5′RACE Outer和Inner引物进行两轮PCR反应；用DNA回收试剂盒（QIAEXⅡ）回收目的片段，回收产物与pMD-19T载体（TaKaRa）连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选挑取阳性克隆，菌落PCR检测，结果为阳性的菌液送上海生工公司测序.

3′端序列扩增同样按TaKaRa 3′-Full RACE Kit说明步骤，将鹅总RNA稀释成500 ng/μL，取1 μL进行反转录反应，再分别用MYL1-3′RACE Outer和Inner引物进行两轮PCR反应，后续步骤同上.

1.5 不同胚胎发育时期MYL1 mRNA表达分析

将不同胚胎发育时期鹅总RNA稀释成同一浓度（100 ng/μL），每个时期3个个体，取5 μL RNA进行反转录反应，再运用荧光定量 PCR检测，反应体系总体积为 20 μL：SYBR Premix ExTaqTMII（2×）10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.4 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase-free dH2O 7.8 μL；qRT-PCR扩增条件为：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃34 s 40次. 在AB（应用生物系统）公司的7500型实时荧光定量PCR仪上进行.

1.6 鹅MYL1基因生物信息学分析

利用在线工具DNAMAN和ClustalX1.83软件做同源性比对，用MEGA 4.1软件中的Kimura 2-parameter法计算净遗传距离矩阵，并以距离矩阵邻接法（Neighbor-Joining，NJ）构建系统进化树.通过ExPASy蛋白质组服务器中的ProtParam工具预测鹅MYL1蛋白的理化性质.应用NCBI上的“BLASTP”程序分析MYL1蛋白的功能属性.

1.7 数据收集和分析

对不同鹅胚胎发育时期的样品内标基因GAPDH和目标基因MYL1分别进行实时荧光PCR检测，测定其Ct值，根据相对实时荧光定量PCR 2-ΔCt值法，算出每个样品中GAPDH基因与MYL1基因表达的相对值.在Excel中作出MYL1mRNA不同发育时期腿肌组织中表达量的柱状图.并用SPSS软件进行显著性检验.

2 结果分析

2.1 鹅MYL1基因全长cDNA克隆及序列分析

通过同源比对设计特异性引物，以鹅肌肉总RNA为模板，反转录后得到cDNA，用引物MYL1outer F/R进行PCR扩增，扩增后通过1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得长度为450 bp左右片段（图1）.经过3′RACE和5′RACE各两轮PCR后，分别获得1000 bp和500 bp的特异性条带（图2）.克隆测序后用DNAMAN5.0软件进行序列拼接，去除重叠序列，得到1 542 bp的鹅MYL1cDNA全序列.包含582 bp的开放性阅读框，其起始密码子为AUG，终止密码子为UGA，共翻译编码193个氨基酸，5′-UTR为108 bp，3′-UTR为852 bp（图2），GenBank登录号：KF986326.

图1 鹅MYL1基因cDNA扩增(M：DL-2000 DNA marker)

2.2 鹅MYL1基因生物信息学分析

通过ExPASy蛋白质组服务器中的ProtParam工具分析鹅MYL1预测蛋白的生理生化特征，其等电点为5.12，分子量为21.75 KD，由3633个原子组成，分子式为C964H1528N252O297S11，负电荷氨基酸残基总数为36（Asp+Glu），正电荷氨基酸残基总数为 28（Arg+Lys），不稳定系数为43.18.通过ProtScale工具分析其亲疏水性，发现最小值为-3.000，位于第16个氨基酸残基，具有高亲水性，而最大值为1.144，位于第116个氨基酸残基，有较强的疏水性.进一步分析亲疏水性区域，在5～33，50，64，64，99～102，125～127，165，166等区域具有高亲水性（score<-1.5）（图 3）. 利用NCBI上 Blasp预测鹅MYL1蛋白结构域，结果显示MYL1含有一个典型的EFh（EF-hand， calcium binding motif） 和 FRQ1（Ca2+-binding protein，EF-hand superfami⁃ly）保守结构域（图4），这两种结构都是钙结合蛋白位点，这与其他肌球蛋白轻链基因结构相似.

图2 鹅MYL1基因全长cDNA的核苷酸及氨基酸序列

图3 鹅MYL1基因氨基酸亲疏水性图谱

2.3 鹅MYL1系统发育分析

通过DNAMAN软件进行序列比对发现，鹅MYL1基因CDS区序列与鸭同源性最高为98.28%，与哺乳类同源性在66%左右；进一步比对氨基酸序列，与鸭的氨基酸同源性高达100%，与哺乳类的MLC1f同源性在65%～69%，由于相差40个氨基酸残基，所以与哺乳类的MLC3f同源性较低，仅在55%左右（见表2）.利用MEGA 4.1软件构建包括红原鸡、爪蟾、小鼠等9个物种的分子进化树.结果表明哺乳类聚成一支，鹅与鸭聚为一支，自展值为100（图5）.不同物种MYL1系统发育与物种间的亲缘关系及形态分类基本一致.

图4 鹅MYL1蛋白结构域的预测结果

2.4 鹅MYL1mRNA胚胎表达分析

表2 鹅与其他物种MYL1基因编码区的同源性比较

实时荧光定量PCR分析表明，鹅胚胎期MYL1基因mRNA表达量总体呈现上升后下降的趋势，该基因在E7就有表达，E7以后表达量逐渐上升，在E18表达量达到高峰后下降（图6）.通过SPSS软件进一步分析不同日龄的鹅胚腿肌MYL1基因mRNA的表达量，发现E18与E14、E28差异显著（P<0.05）.

3 讨论

肌球蛋白轻链是肌球蛋白的一个亚基.肌球蛋白轻链拥有自己的肽链，这点与重链不同.它们不被包括在肌球蛋白家族中，但对形成肌球蛋白酶催化超分子复合体有重要作用.轻链基因有：MYL1、MYL2、MYL3、MYL4、MYL5、MYL6等基因，分ELC和RLC两种类型，不同的ELC和RLC的家族成员由多种基因编码，而且同型异构体可呈现出不同的表达谱.在哺乳动物ELC家族中，MYL1在快骨骼肌中表达；MYL3（ELCv）主要在心室和慢骨骼肌中表达；MYL4（ELCa）在胎儿和成体的心房以及骨骼肌中表达；MYL6在平滑肌中表达.在RLC家族中，MYL2（MLC2v or RLCv）在心室中表达，MYL7（MLC2a or RLCa）在心房中表达；MYL5在骨骼肌中表达；MYL9在平滑肌中表达.一般认为肌球蛋白轻链对肌肉的收缩有调节作用，但研究认为在横纹肌中这种调节作用很弱[10-11].

图5 不同物种推导的MYL1氨基酸序列构建的NJ树

图6 鹅MYL1基因在不同胚胎发育时期腿肌中表达量

多个哺乳动物MYL1基因由不同的启动子调控，存在MLC1f和MLC3f两种异构体，并且这两种异构体出现在胚胎形成的不同时期中：在小鼠中，MLC1f转录体是从胚胎骨骼肌的分化时期（E9）开始积累，而MLC3f转录体从胚胎骨骼肌E13.5～E15时期开始大量积累[12].在小鼠的胚胎肌肉发育阶段，MLC1f、MLC3f表达方式是相互独立的，即在胚胎发育不同时期出现[13]，并认为MYL1基因的表达是快肌纤维出现的特征[14].同样的发现MYL1基因在斑马鱼胚胎发育早期就有表达，早于其他已知快肌蛋白标志，并发现该基因的表达受到MyoD和Myf5基因的调控[15].Ling等鉴定了猪MYL1基因mRNA 5个选择性剪切体（MLC1f、MLC3f、MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C），并在猪背最长肌中首次鉴定出了MLC5f-A、MLC5f-B和MLC5f-C 3个新转录本，MLC1f、MLC3f在骨骼肌和心肌中高表达，而三个新转录本仅仅在骨骼肌中表达；发现除了剪切体MLC1f外，其余转录本的表达量均为随个体体重的增加而逐步增加，到成年时表达量迅速增至最高[7].

本研究通过RACE技术首次克隆获得鹅MYL1基因全长1542 bp的cDNA序列，包含582 bp的开放性阅读框，编码含193个氨基酸残基的蛋白质，碱基序列及蛋白质前体氨基酸序列与其他物种高度同源，并与MYL1f基因同源性更高，推测我们克隆的为MYL1f基因，至于鹅是否存在MYL3f基因有待于进一步研究.对鹅MYL1蛋白序列进行功能位点分析发现其编码氨基酸残基包含一个典型的EFh和FRQ1这两个结合钙蛋白保守结构域，推测MYL1基因与钙离子结合密切相关，是一种钙结合蛋白.通过荧光定量检测MYL1基因在不同发育时期腿肌中的表达量，发现该基因在胚胎早期就有表达，并在E18天表达量达到高峰.说明胚胎早期就有肌肉的形成和发育.

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