肉鸡IGF-I基因mRNA的时空表达模式

顾海娟，王星果，王慧娟，邵 芳，顾志良

（常熟理工学院 生物与食品工程学院，江苏 常熟 215500）

动物的生长发育受体内外各种因素的作用，并由机体的神经内分泌系统的生长轴进行调控.生长轴是由“下丘脑—垂体—（生长激素）—靶器官”上有关激素及受体组成的神经内分泌轴.GH经血液循环运至靶组织或器官，通过两种方式发挥作用：一是直接作用，GH直接与细胞膜表面的生长激素受体（growth hor⁃mone receptor，GHR）结合，启动细胞内的信号转导机制，从而参与靶器官的代谢活动，调节生长发育；二是间接作用，GH先与靶细胞表面的GHR结合，作用于靶器官，产生类胰岛素生长因子（insulin-like growth fac⁃tors，IGFs），后者再通过内分泌、旁分泌或自分泌途径作用于肌肉和骨骼等靶器官，调节细胞的代谢，促进动物的生长发育[1].鸡的生长也不例外，同样依靠生长轴的作用来调节自身的生长.

类胰岛素生长因子，是生长激素产生生理作用过程中必须的一种活性蛋白多肽物质[2].IGF-I是一种含有70个氨基酸的碱性单链多肽，广泛存在于机体组织中，具有调节机体生长发育、生殖、免疫和机体代谢的功能[2].鸡IGF-I的一级结构首先由Rinderkneeht和Humkel（1978）阐明，与胰岛素49%同源[3].1996年，Klein等通过原位杂交和遗传连锁分析，将鸡的IGF-I基因定位在1号染色体的短臂近着丝粒处.Yoshitaka Kaji⁃moto等（1991）通过对鸡的IGF-I基因进行克隆和序列分析，发现其组成是4个外显子和3个内含子，长度为50 kb，且成熟的IGF-I多肽由外显子2、3编码，而外显子1、4分别编码N末端和C末端及一些非编码序列.因为选择性剪接和选择性加尾，鸡的IGF-I基因会产生两条不同的mRNA[4].

动物肌肉的生长发育与IGFs系统基因的时空特异性表达密切相关[5-7]，但目前关于其发育表达模式的资料较少，肉鸡不同组织和肌肉、脂肪和肝脏IGFs基因表达的发育性变化模式还有待进一步探讨.对于IGFs发育表达模式的研究，将有助于了解动物生长过程中激素调控的本质.本实验选取不同发育时期的白羽AA肉鸡（八个不同发育阶段，各阶段3个样品，总共24个样品），通过实时荧光定量PCR技术来研究肉鸡IGF-I基因mRNA的时空表达特征.实验结果将为研究IGF-I基因在肉鸡发育过程中的调控机制提供资料，为揭示IGF-I基因在肉鸡早期生长发育中的功能奠定一定的基础.

1 材料与方法

1.1 实验样品

本研究采集出生后1日龄及1周龄、2周龄、3周龄、4周龄、5周龄、6周龄、7周龄的AA白羽肉鸡（每周龄分别选取三只样品鸡，总共24只样品鸡）胸肌、腿肌、脂肪、心脏、肝脏、脾、肺、肾、肠、腺胃、肌胃和脑12个组织样品，迅速置于液氮中速冻，并于-80℃冰箱中保存.用TRIzol试剂提取不同组织和不同发育时期肌肉、脂肪、肝脏的总RNA.

1.2 引物设计与合成

根据已经报导的鸡IGF-I和β-actin基因序列设计引物chiIGF1F1：5′-TTAACCAGTTCTGCTGCTGC-3′chiIGR1：5′-TGGTGTAAGCGTCTACTGCT-3′；dubactinqF：5′-CACGGTATTGTCACCAACTG-3′，dubactinqR：5′-ACAGCCTGGATGGCTACATA-3′.引物由上海生工生物工程有限公司合成.

1.3 IGF-I基因表达的实时荧光定量PCR检测

采用两步PCR法进行荧光定量PCR.对RNA样品首先进行逆转录反应，然后进行实时荧光定量PCR，反应体系：Power SYBR Green PCR Master Mix 10μl，正反向引物（10 μmol/L）各 1 μl，去离子无菌水6.67 μl，RT产物1.33 μl.反应条件为95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 sec，60 ℃ 1 min，PCR扩增后进行熔解曲线分析，温度以0.5℃/30 S的速率从55℃缓慢递增到95℃.

1.4 数据收集和分析

本实验选择相对定量荧光PCR法，通过在不同组织中内标β-actin和目标基因IGF-1分别进行实时荧光PCR检测，测定其Ct值，根据相对实时荧光定量PCR 2-ΔCt值法，算出每个样品中IGF-1基因与β-actin基因表达的相对值.在Excel中作出IGF-1mRNA相对于β-actin表达量的柱状图.并用SPSS12.0进行显著性检验.实时荧光定量PCR结果用均值±标准差表示.

2 结果与分析

2.1 肉鸡IGF-I和β-actin基因的RT-PCR产物检测

随机选取总RNA样品，首先进行反转录反应，以获得肉鸡的cDNA，然后进行实时荧光定量PCR的预实验.即选用IGF-I、β-actin这两对引物，以反转录产物cDNA为模板，进行RT-PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳来检测产物是否进行了特异性的扩增.经电泳发现扩增条带均位于DNA Marker 100～250 bp之间，且扩增条带大小与设计相符，说明目的基因得到了PCR扩增，而且产物特异性非常好，故可以用于荧光定量PCR检测.

2.2 肉鸡不同组织中IGF-I基因mRNA表达

IGF-I基因mRNA在4周龄肉鸡的12个组织中的表达呈现组织差异性.在肝脏中IGF-I基因mRNA表达量最高，显著高于其余11个组织的表达量；表达量次之的是肺，但其量相对于肝脏中的表达还是较少的；其次在胸肌、腿肌、心肌中的表达量均稍低于肺；在脂肪、脾、腺胃、肌胃、肠、脑中的表达量都很少，脂肪、脑中的表达量相对于脾、腺胃、肌胃、肠略高，在脾这些组织中表达极微量；而在肾脏中未检测到有IGF-I基因mRNA的任何表达.肝脏中IGF-I mRNA的表达与其余各组织的表达量均存在显著差异，说明其表达量显著高于其他组织.可知4周龄肉鸡的肝脏中大量表达IGF-I基因，这些高表达的IGF-I可以以内分泌、自分泌和旁分泌作用来调控肝脏的生长发育（见图2）.

图1 IGF-I和β-actin的PCR扩增片段(M：DL-2000 DNA marker)

图2 鸡IGF-I基因的mRNA在12种不同组织的表达

2.3 肉鸡不同发育时期的IGF-I基因mRNA表达

各发育时期的腿肌中表达量最高的是6周龄；其次是4周龄，其表达量比6周龄时的表达略低；在1、3、5周龄时的表达量相近；在2周龄时的表达比在1、3、5周龄中的表达量少些；然后是7周龄时的表达，其又少于2周时期；出生后1日龄的个体表达量最少，呈微量.经显著性检验发现1日龄的表达量与3、4、6周龄时的表达量存在显著差异，7周与4、6周龄的表达量呈显著性差异.说明这些时期的表达量相差较大，IGF-I在不同时期腿肌的发育中均有着重要作用，见图3.

脂肪中3周龄个体的IGF-I基因mRNA表达量最高，明显高于其他各时期；4、5周龄的表达量相似，但5周时表达比4周时略高；其次是6周个体的表达，约是4周的1/2；而在7周时呈极微量表达.就整体趋势而言是随着年龄的增长其表达量而随之减少.3周与7周间的表达呈显著差异，3周的表达量显著高于7周.提示IGF-I对肉鸡脂肪组织的作用主要体现在发育早期，见图4.

图5显示肝脏中表达量最高的是3周龄的个体；其次是2周个体，其表达量比3周的略少；5周龄个体的表达量比2周龄少，表达量较中；4、6、7周龄个体的表达量相似，但是7周时比其他两个时期少；在1周龄时呈微量表达；而出生后1日龄时表达量呈极微量.在肝脏中IGF-I表达的整体趋势相近于刚出生时IGF-I mRNA的表达量，随年龄增大其表达量逐渐增加，但到一定时期其表达量又趋近平稳.与腿肌、脂肪的同一发育时期相比，其IGF-I基因mRNA的表达显著高于二者.肝脏中IGF-I基因mRNA发育性表达不表现显著差异.

图3 腿肌不同发育时期IGF-I基因mRNA的表达量

图4 脂肪不同发育时期IGF-I基因mRNA的表达量

3 讨论

GH的重要调节作用，其除了与靶组织、器官的GHR结合而直接发挥其促生长作用外，还可以促进靶器官产生IGF-I.IGF-I以内分泌、旁分泌、自分泌的形式促进各组织器官的生长发育.同样，鸡的GH也需要与受体有效结合，并最终依赖IGFs的表达来实现其促生长作用.

从实验结果可知，4周龄肉鸡的12个不同组织中，肝脏的IGF-I表达量最高，与其余11个组织中的表达量均存在显著差异，说明肝脏是产生IGF-I的主要场所，是IGF-I发挥内分泌、自分泌、旁分泌的主要靶器官.除肝脏外，在胸肌、腿肌、脂肪、心肌、肺、脑中均有少量表达，而在腺胃、肌胃、肠中仅有微量表达，但在肾脏中没有表达.说明鸡个体的许多组织器官均可产生IGF-I，从而发挥其自分泌、旁分泌作用.

图5 肝脏不同发育时期IGF-I基因mRNA的表达量

IGF-I在肌肉中的过量表达可显著促进肌肉的生长发育，这已在转基因鼠和鸡上得到证实[8].本实验结果也显示IGF-I基因mRNA在腿肌中出生后表达量呈不同程度的增加，在六周龄时达到最大值，七周龄时开始下降.从出生后1周到6周，其IGF-I基因mRNA的表达量均较高，3、4、6周时表达量与刚出生1天的个体表达量出现显著差异，说明这些时期的肌肉生长需要大量的IGF-I作用.而该段时间也是鸡腿肌逐渐发育的时期，由此表明，在鸡腿肌发育较快时期，腿肌中IGF-I表达量也相应较高，说明IGF-I对腿肌的生长发育具有重要作用.这一结果与王勇生等在北京鸭胸肌中IGF-I的发育性表达变化研究结论相似[8].说明IGF-I对禽类的肌肉生长具有重要作用.Duclos（2005）发现鸡肌肉组织IGF-1的自分泌对其生长起主要作用.有研究发现，使用促进剂使IGF-I基因的表达仅限制在骨骼肌时，会出现显著的肌肉营养过剩现象，但体重与血清IGF-I浓度并未增加，表明局部产生的IGF-I可在动物生长调节中发挥重要作用[8].因此，推测鸡腿肌组织产生的IGF-1对鸡腿肌的发育也具有局部效应，其可以明显促进鸡腿肌的生长发育.

肝脏是IGF-I的主要分泌器官.IGF-I的表达量在出生早期较少，随年龄增大其表达量也逐渐增加，但到一定时期其表达量又趋近平衡，各时期的表达无显著差异，说明IGF-I在肝脏早期生长发育的各阶段均具有一定的作用.刘国庆等[9]在羔羊肝脏中对IGF-I和IGF-IR基因表达的发育性变化研究中得出的结论也是IGF-I的表达量先是随年龄的增大其量也增加，然后再逐渐下降，与本实验的研究结果相似.

体内和体外的实验均表明，IGF-I可能是脂肪细胞增殖和分化所必需的关键因子之一，IGF-I可能通过内分泌或（和）旁（自）分泌促进脂肪组织的发育[10].在鸡脂肪的不同发育时期IGF-I基因mRNA的表达量是随着周龄的上升而呈渐渐下降的趋势，7周的表达量与3周的量存在显著性差异，说明脂肪细胞的增值主要发生于生长早期.提示IGF-I主要在鸡生长发育的早期促进脂肪细胞的增殖和分化.这与周杰等[11]在二花脸和大白猪的脂肪组织中GHR、IGF-I和IGF-IR基因表达的发育性变化研究中的结果相同.

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