响应面法优化耐盐烃降解菌培养基的初步研究＊

徐斌 张祥胜

（1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室；2.盐城师范学院生命科学与技术学院）

响应面法优化耐盐烃降解菌培养基的初步研究＊

徐斌1，2张祥胜1，2

（1.江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室；2.盐城师范学院生命科学与技术学院）

海洋溢油污染对海洋和沿海滩涂生态环境造成严重威胁，筛选耐盐烃降解菌株和优化烃降解菌培养条件至关重要。以实验室筛选的一株烃降解菌为研究对象，在已有的单因素试验的基础上，采用响应面法对烃降解菌培养基进行优化，结果表明：当酵母粉质量浓度为2.74 g／L，NH4NO3质量浓度为1.47 g／L，磷酸盐质量浓度为1.22 g／L时，烃降解率为65.81%，比单因素优化试验最优水平下的烃降解率增加14.58个百分点。

产表面活性剂烃降解菌；响应面法；培养基优化

0 引 言

随着石油的广泛利用，石油污染也随之而来，特别是在石油勘探、开采、运输、炼制等过程中，由于处理不当或意外事故，将会引起油品的泄漏［1］。石油污染物进入土壤，会堵塞土壤孔隙，使土壤透气性降低，破坏土壤微生态环境。土壤中的石油向下渗漏，可能导致地下水污染［2］，向空气中散发，会污染空气，威胁人类健康［3］。溢油事故、海上钻探泄漏等造成的海洋石油污染，对海洋和沿海滩涂生态环境的破坏更是灾难性的［4］。在诸多石油污染修复方法中，微生物修复技术被公认为是治理石油污染的较好方法，日益受到人们的广泛关注［4-6］。温度、盐度、营养条件、溶氧量等环境因素影响烃降解菌的降解效率，尤其是营养盐，对海洋烃降解菌的降解效率有一定影响［7］。因此，结合菌株筛选，进行降解条件的优化很有必要。响应面法是一种优化试验设计的方法，具有试验次数少、结果精确等优点［8-9］，但尚未在烃降解菌培养基优化中得到广泛应用［10］。

本研究通过对自行筛选的一株耐盐石油降解菌株，采用响应面法对培养基主要成分进行了优化，以更有效地发挥烃降解菌的生物修复潜力，为日后该菌株的推广和进行针对性的现场修复提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 培养基

种子培养基成分：蛋白胨10 g／L，牛肉膏3 g／L， NaCl 5 g／L。培养基p H值在7.0～7.2，经121℃高压灭菌20 min。

烃降解菌的基础培养基成分：MgSO4·7H2O 0.2 g，NH4NO31 g，磷酸盐1 g（KH2PO4、K2HPO4两种磷酸盐均为1 g），FeSO40.05 g，CaCl20.02 g，酵母粉1 g，NaCl 35 g，原油5 g，去离子水1 L。p H值7.0～7.2，121℃高压灭菌20 min。进行参数优化时，培养基待优化成分根据实验方案进行设置。

1.2 菌株来源

菌株J3是由大庆油田污染土壤中分离筛选出的产表面活性剂烃降解菌［11-12］，经鉴定为铜绿假单胞菌，对石油烃的降解率可达48%。进行响应面法优化试验前，菌株进行了连续多代驯化，以充分发挥其降解性能。

1.3 响应面法对烃降解菌培养基的优化

1.3.1 烃降解菌培养基的优化

在已有的烃降解菌培养基单因素优化的基础上，以酵母粉浓度、NH4NO3浓度、磷酸盐浓度为自变量，利用三因素三水平的Box-Benhnken响应面分析法进行试验。以烃降解率为响应值，对烃降解菌培养基进行优化，共17个试验点，其中一类为12个析因点，另一类为5个中心点。试验因素水平见表1。

1.3.2 烃降解率的计算方法

取贮存于4℃的斜面培养基1支，用接种环刮取菌苔，接种于存有50 m L肉汤培养基的150 m L摇瓶内，放入恒温摇床中，在180 r／min，30℃条件下培养24 h。按5%的比例接种于烃降解菌培养基中，在180 r／min，30℃条件下恒温培养7 d后用重量法测定剩余石油烃的质量［13-14］。烃降解率计算公式如下：

表1 Box-Benhnken试验因素水平

2 结果与分析

2.1 回归方程的建立

采用Design-Expert V8.0.6.1软件对数据进行降解率回归方程的建立，该模型对应的回归方程：

2.2 响应面图以及等高线分析

响应面图是各个试验因子在交互作用下得到的响应值的结果构成的一个三维空间曲面。根据Design-Expert软件V8.0.6.1可得到响应图，如图1所示。结果表明，当酵母粉质量浓度在1.00～2.50 g／L，NH4NO3质量浓度在0.70～1.50 g／L时，两者之间有增效作用，且降解率随着浓度增加而增加；而当酵母粉质量浓度在2.50～3.00 g／L，NH4NO3质量浓度在0.50～0.70 g／L时，降解率随着浓度增加而下降，见图1（a）。当酵母粉质量浓度在1.00～2.50 g／L，磷酸盐质量浓度在0.7～1.50 g／L时，两者之间有增效作用，且降解率随着浓度增加而增加；而当酵母粉质量浓度在2.50～3.00 g／L，磷酸盐质量浓度在0．50～0.70 g／L时，降解率随着浓度增加而下降，见图1（b）；当NH4NO3质量浓度在0.50～1.50 g／L，磷酸盐质量浓度在0.50～1.50 g／L时，两者之间有增效作用，且降解率随着浓度增加而增加，见图1（c）。

由回归方程和Design-Expert软件分析结果，可获得最优配方：酵母粉质量浓度2.74 g／L，NH4NO3质量浓度1.47 g／L，磷酸盐质量浓度1.22 g／L，此时烃降解率存在最大值，其理论值为65.81%，与烃降解菌培养基单因素试验的最优水平下的降解率相比，提高了14.58个百分点。

图1 响应面试验等高线

3 结 论

经响应面法优化的烃降解菌培养基，在含NaCl 35 g／L的情况下，培养基最优配方为酵母粉质量浓度为2.74 g／L，NH4NO3质量浓度为1.47 g／L，磷酸盐质量浓度均为1.22 g／L，此时理论烃降解率为65．81%，比单因素优化试验最优水平下的烃降解率提高了14.58个百分点。本实验各因素不同水平的组合中，最高降解率为65.16%，接近理论最高值。

本研究在优良菌株筛选的基础上，应用响应面法提供了最优培养基的理论成分组成，为可能的溢油污染或沿海滩涂石油污染的生物修复提供了技术支持，对保护海洋滩涂生态环境也将发挥积极作用。

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1005-3158（2014）02-0007-02

2013-11-01）

（编辑 李煜）

10.3969／j.issn.1005-3158.2014.02.003

国家自然科学基金项目（No.10905035）和江苏省滩涂生物资源与环境保护重点建设实验室开放课题（JLCBE11010）资助。徐斌，盐城师范学院生物技术专业在读硕士，研究方向：环境微生物。通信地址：江苏省盐城市希望大道盐城师范学院新长校区，224051