雷公藤多苷对脂多糖致急性肺损伤大鼠保护机制研究

邹 蕾，黄志远，崔 岩，高 燕

沈阳军区总医院急诊医学部，辽宁沈阳 110016

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由于多种因素导致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤，造成肺间质及肺泡弥漫性水肿，进而导致急性呼吸功能不全［1］。ALI是导致急重症患者死亡的常见原因之一，ALI患者死亡率极高，目前尚未发现有效的干预措施［2］。因此，寻找有效的治疗药物是治疗急性肺损伤亟待解决的难题之一。近年来研究核转录因子-κB(NF-κB)通路是炎症反应发生的中枢环节之一，它在ALI-急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发病机制中发挥重要作用［3，4］。雷公藤多苷(tripterygium glycosides，GTW)具有明显的抗炎、免疫抑制、抗生育及抗肿瘤活性作用，含雷公藤多甘的中药制剂常用于治疗关节炎、自身免疫性紊乱、器官移植、糖尿病肾病、哮喘及肿瘤等多种疾病抗氧化、抗炎、抗黏附作用［5，6］。然而，雷公藤多苷对急性肺损伤中的保护作用及机制尚不清楚。因此，本实验通过复制ALI模型，旨在研究雷公藤多苷对急性肺损伤的保护机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 脂多糖、鼠抗NF-κB多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的兔抗IGg(美国Sigma公司)。二步法免疫组织化学检测试剂盒(中衫金桥试剂公司)。雷公藤多苷(湖南千金协力药业有限公司)。血气分析仪(美国Nova Biomedical);Olympus生物显微镜，Image Pro Plus数码显微镜照相分析软件。

1.2 方法

1.2.1 建立急性肺损伤模型 60只雄性清洁级Wistar大鼠，体重200～220 g，购自上海西普尔必凯实验动物有限公司。据实验设计，动物随机分为对照组(NS组)、急性肺损伤组(LPS组)和雷公藤多苷干预组(GTW组)。实验过程中，LPS组和GTW组分别通过股静脉注射5 mg/kg LPS，建立急性肺损伤模型。GTW组在注射LPS前30 min，静脉注射10 mg/kg GTW，NS组和LPS组给予等量生理盐水。

1.2.2 测定动脉氧分压 实验结束后，腹主动脉取血0.5 ml，采用血气分析仪测定各组动物的PaO2。

1.2.3 标本采集 造模后9 h，采用戊巴比妥钠2.0 mg/kg腹腔麻醉大鼠，逐层解剖大鼠胸部组织，分离肺脏，剔除结缔组织，用生理盐水清洗血液，用分析天平称重。分离右肺上叶，用10%甲醛溶液固定，用于病理形态学观察;将剖取的右肺下叶置于-80℃液氮罐中，用于检测NF-κB蛋白表达。

1.2.4 肺组织湿/干重比(W/D) 称取左上肺湿重后，将其置于65℃恒温烤箱中，烘烤48 h，待其重量稳定后，称量肺脏干重，计算肺湿/干重比。

1.2.5 炎症细胞因子检测 采用ELISA方法，检测肺组织匀浆液中炎症因子表达，组织匀浆液的制备过程参照说明书。炎症因子IL-β、IL-6、IL-10及TNF-α检测及浓度计算参考试剂盒说明书。

1.2.6 Western blot检测 提取大鼠肺组织总蛋白用于肺组织中NF-κB和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)表达检测。取30 mg肺组织于500 μl瑞帕(RIPA)中匀浆，并加入5 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物，0℃条件下匀浆20 min，匀浆后14 000 r/min离心15 min，取400 μl上清液备用。Western blot实验按常规方法进行。抗NF-κB抗体工作稀释度为1：500，抗GAPDH为1：500;二抗辣根过氧化物酶标记的IgG二抗为1：1 000。使用软件计算NF-κB灰度值比。

1.3 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件进行分析，数据均采用(±s)表示，定量数据采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 动脉PaO2分析结果 LPS注射后大鼠呼吸、心率明显增快，反应淡漠，精神萎靡。与对照组相比，LPS组PaO2水平明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)，而GTW组PaO2较LPS组有明显改善，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 肺组织湿/干重(W/D)比值测定 LPS组大鼠肺湿干比W/D值，较对照组明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);而GTW组肺湿干比W/D值明显低于LPS组，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 肺组织病理形态学变化 光镜下，对照组肺泡间隔厚度适中，肺泡壁完整，间质无炎症细胞浸润(图1A)。LPS组与对照组相比，肺泡间隔明显增宽，肺泡腔有渗出物，间质炎细胞浸润明显(图1C)。GTW组肺组织存在淤血、出血及间隔增宽等现象，间质可见少量炎细胞浸润，肺损伤程度较LPS组减轻(图1E)。

2.4 肺组织NF-κB免疫组化表达 免疫组化结果显示，NF-κB在对照组肺组织没有表达(图1B)。LPS组肺组织NF-κB蛋白表达明显增强(图1D)，GTW组肺组织NF-κB蛋白表达较LPS组降低(图1F)。

图1 各组病理形态学及免疫组化结果比较

2.5 炎症因子表达检测 与对照组相比，LPS组促炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显升高，而抑炎因子IL-10水平明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)。与LPS组相比，GTW组上述炎症因子表达明显改善，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 各组炎性因子表达比较

2.6 NF-κB蛋白表达比较 与正常组比较，LPS组大鼠NF-κB蛋白及mRNA表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.05);与LPS组比较，GTW组大鼠NF-κB蛋白及mRNA表达明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图3。

3 讨论

急性肺损伤是指肺内外各种致病因素导致的急性进行性缺氧性呼吸衰竭，急性呼吸困难、难治性低氧血症和双侧肺部浸润性病变是其典型表现。本研究结果显示，LPS可以导致急性肺损伤大鼠动脉血气PaO2明显降低，肺组织湿/干重比升高，肺泡间隔明显增宽，部分肺泡腔可见渗出物，间质有大量炎细胞浸润等典型的肺损伤改变，同时导致促炎症因TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平较对照组明显升高，而抑炎因子IL-10水平明显下降。TNF-α、IL-1β、IL-6是人体重要的抗炎因子，在炎症发生中这些因子表达明显升高，而IL-10则是重要的抗炎因子之一，其高表达可抑制炎性反应，保持炎症反应在体内的动态平衡［7］。急性肺损伤时抗炎因子分泌量明显减少，不能有效的对拮抗炎性因子所导致的炎症反应，势必会导致炎症细胞在肺间质内的大量浸润、组织水肿、器官功能损害，极大地增加患者的死亡风险。有报道显示，急性肺损伤死亡患者的疾病初期，可发现肺泡灌洗液中的IL-10浓度较低［8-10］。结果提示，IL-10蛋白分泌降低可能是导致TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子表达增多及肺内炎症反应加重的主要原因。

图3 各组NF-κB蛋白表达水平比较

雷公藤是最常见的中药之一，具有活血通络、消肿止痛等功效，在临床上多用于治疗类风湿、肾病、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病［11，12］。研究证实，雷公藤具有较好的抗肿瘤、抗炎及抗氧化等作用，而雷公藤多苷是从雷公藤的去皮根部提取的总苷，是其主要有效成分。研究发现，雷公藤多苷通过抑制NF-κB蛋白，促进前列腺癌的凋亡［13］。有文献报道，雷公藤多苷抑制糖尿病肾病大鼠炎症因子IL-6、TNF-α和NF-κB蛋白的表达，从而达到减轻肾病的效果［14］。雷公藤多苷可以减轻肺组织的炎症反应，明显改善大鼠的肺功能，机制可能与上调改善 IL-10、Foxp3和下调 TNF-α表达密切相关［15］。本研究发现，雷公藤多苷可明显改善急性肺损伤大鼠的动脉血PaO2水平，降低肺脏湿/干重比，改善肺组织病理学改变，下调TNF-α、IL-1β及IL-6和上调IL-10蛋白表达。免疫组织化学及Western blot检测发现，LPS组NF-κB蛋白表达明显升高，而雷公藤多苷明显降低肺组织NF-κB蛋白表达。使肺损伤程度减轻。NF-κB可以与多种基因启动子部位的κB位点发生特异性结合，进而促进转录的核因子，经典的NF-κB是p65/p50二聚体结构，NF-κB激活后可以促进TNF-α等炎症因子的生成，参与机体的炎症反应［16］。研究证实，LPS通过激活NF-κB蛋白诱发大量促炎因子生成是急性肺损伤发病的中心环节，NF-κB激活是炎症反应蛋白表达的终末控制点，故降低NF-κB活性可能是治疗ALI的一个有效方案［17］。本研究表明，雷公藤多苷可明显减轻LPS导致的肺部急性炎性反应，其保护机制可能与下调NF-κB蛋白表达有关。雷公藤多苷具有治疗急性肺损伤的潜在价值，并为其治疗提供新的理论依据。

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