iNOS、TGF-β1在哮喘大鼠中性粒细胞中的表达及其意义

叶辉，应小明，马江林，童夏生，赵蓓

（1.温州医科大学附属黄岩医院 儿科，浙江 台州 318020；2.台州市中西医结合医院 儿科，浙江台州 317523）

哮喘是一种气道慢性炎症性疾病，由多种炎症细胞和炎症组分参与，其中包括中性粒细胞（PMN）及其分泌产物。PMN在哮喘急性发作时被激活，分泌多种酶、炎症递质和细胞因子等，共同参与哮喘的炎症过程[1]。研究发现，炎症因子诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、转化生长因子（TGF-β1）在哮喘的气道炎症和气道重构中起着重要作用[2-3]。本实验通过制备哮喘动物模型，检测iNOS、TGF-β1在PMN中的表达水平，探讨PMN参与哮喘发病的可能机制。

1 材料和方法

1.1 试剂 卵白蛋白（OVA）和Histopaque 1119、Histopaque 1083分离液购自美国Sigma公司，山羊抗大鼠iNOS一抗免疫组织化学试剂盒购自美国Santa Cruz公司，小鼠抗大鼠TGF-β1单克隆抗体购自英国Abcam公司，兔抗山羊二抗试剂盒购自上海晶美公司。

1.2 实验动物及分组 SPF级健康雄性SD大鼠20只，6～8周龄，体质量（234±19）g，由温州医科大学实验动物中心提供[动物批号：SCXK（浙）2005-0019]，在SPF级环境中饲养。随机分成哮喘组和对照组，每组10只。

1.3 模型的复制 参照文献[4]，于实验开始第1天和第8天分别腹腔注射OVA/Al（OH）3混合液1 mL[内含OVA 1 mg和Al（OH）3100 mg]致敏；第15天开始使用空气压缩雾化器（由德国百瑞公司生产）向置于密闭有机玻璃容器内的大鼠喷雾1% OVA，每天吸入30 min，连续激发7 d。哮喘大鼠表现为烦躁不安、瘙痒、喘鸣、腹肌抽搐等症状。对照组致敏和激发均以0.9%氯化钠溶液替代OVA/Al（OH）3混合液和OVA溶液。

1.4 血PMN的分离纯化 大鼠末次激发24 h后，1%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉，心脏抽血4 mL，抗凝后加至备有分离液（Histopaque 1119和Histopaque 1083各4 mL）的离心管中，4 ℃，700 r/min离心（KDC-1044低速离心机由科大创新股份有限公司生产）30 min，取PMN富集层，低渗法溶解红细胞，锥虫蓝染色查细胞活力＞86%，瑞氏染色显示PMN纯度＞89%，细胞涂片采用免疫组织化学SP法行iNOS、TGF-β1蛋白测定。每张细胞涂片随机计数50个阳性细胞，Image-pro Plus 5.1免疫组织化学图像分析系统对阳性细胞进行灰度扫描，取其平均值代表该片的光密度（OD）值。

1.5 标本的制备 取大鼠左肺组织，经常规固定、石蜡包埋、切片，HE染色，400倍光镜（日本OLYMPUS）下观察肺组织的病理变化和炎性细胞浸润情况。

1.6 统计学处理方法 应用SPSS 16.0统计软件。结果以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织病理改变 大鼠肺组织切片HE染色显示：哮喘组可见细支气管上皮黏膜层增厚，多种炎性细胞浸润，包括PMN、嗜酸性粒细胞、肺泡巨噬细胞、淋巴细胞等，伴有较多黏液形成；对照组细支气管形态规则、管腔内分泌物少，偶见炎性细胞浸润（见图1-2）。

图1 对照组肺组织（HE，×400）

图2 哮喘组肺组织（HE，×400）

2.2 血PMN中iNOS、TGF-β1蛋白的表达 免疫组织化学法显示阳性细胞的胞浆呈棕黄色表达，2组中PMN均有不同程度的表达。哮喘组PMN中iNOS和TGF-β1蛋白的表达水平显著高于对照组P＜0.01（见表1、图3-6）。

表1 血PMN中iNOS、TGF-β1蛋白的表达（OD值，±s）

表1 血PMN中iNOS、TGF-β1蛋白的表达（OD值，±s）

注：实验过程中，哮喘组有1只大鼠死亡

组别 n i N O S T G F-β 1对照组 1 0 0.0 7 6±0.0 1 4 0.1 3 1±0.0 1 5哮喘组 9 0.1 2 2±0.0 1 7 0.2 2 8±0.0 1 6 t-6.4 5 6 -1 3.2 7 1 P＜0.0 1 ＜0.0 1

3 讨论

哮喘被认为是以嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润为主的气道慢性变态反应性疾病，但最近研究发现，PMN在哮喘发病过程中同样具有重要作用。不管是在哮喘急性发作和致命性哮喘中，还是在轻度、中度和重度哮喘中，PMN在气道黏膜中表达均增加，可能对气道炎症和气道重构有积极的促进作用。我们先前研究显示，哮喘急性发作时PMN合成基质金属蛋白酶9（MMP-9）增加，经布地奈德治疗后，其表达水平显著性下降，提示PMN可能部分通过MMP-9参与了哮喘的气道炎症过程[5]。

一氧化氮（NO）被认为是一种重要的内源性气体信号分子，在机体内起着双重的作用。少剂量的NO起着扩张血管和舒张支气管平滑肌等作用，大剂量则可引起气道炎症、水肿、肺损伤等不良反应[1]。iNOS是机体生成内源性NO的主要催化酶之一，在受炎症因子IL-1、TNF-α等刺激后会被诱导而产生，其催化效率较高，一旦其诱导生成，将持续产生NO直至底物耗尽为止[6]。哮喘急性期，大量炎性因子产生，诱导大量iNOS合成，从而产生过量的NO，进一步加重气道炎症和组织的损伤[7]。本实验发现，哮喘组血PMN中iNOS表达显著高于对照组，表明哮喘急性发作期PMN合成iNOS蛋白的功能增加，提示PMN可能通过NO途径参与哮喘气道炎症过程。

图3 免疫组织化学法显示对照组大鼠血PMN iNOS蛋白呈弱阳性表达（×400）

图4 免疫组织化学法显示哮喘组大鼠血PMN iNOS蛋白呈强阳性表达（×400）

图5 免疫组织化学法显示对照组大鼠血PMN TGF-β1蛋白呈弱阳性表达（×400）

图6 免疫组织化学法显示哮喘组大鼠血PMN TGF-β1蛋白呈强阳性表达（×400）

TGF-β1是一种多功能细胞调节因子，在机体免疫调节以及细胞生长和分化等方面均发挥着重要作用。近年来研究[8-9]表明，TGF-β1在哮喘急性发作中起重要作用。Vignola等[10]对哮喘气道标本活检发现气道上皮及黏膜下TGF-β1的表达较健康人明显增高，且表达水平与哮喘的严重程度呈正相关。本实验发现，哮喘组血PMN中TGF-β1表达较对照组明显增高，表明PMN能通过TGF-β1参与哮喘的炎症过程。但洪建国等[11]检测了60例轻、中度哮喘儿童血浆TGF-β1浓度及单个核细胞内TGF-β1 mRNA的表达，发现两者均较对照组明显降低，认为哮喘儿童体内TGF-β1分泌不足，导致细胞免疫功能紊乱，从而形成哮喘发生的环境。因此，对于TGF-β1引起哮喘气道炎症反应和气道重构的具体机制，仍需进行更深入的研究。

以上结果表明，哮喘大鼠血PMN中iNOS、TGF-β1的表达增高，它们可能参与了哮喘的气道炎症过程。因此，探索降低iNOS、TGF-β1等表达水平的方法和药物将可能成为治疗哮喘新的有效途径之一。

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