直肠癌HIF-1α和COX-2的表达与新辅助放化疗敏感性的相关性

徐昶，宋华羽，左志贵，厉金雷，蔡剑辉，吴祥斌

（温州医科大学附属第一医院 肛肠外科，浙江 温州 325015）

近年来，术前新辅助放化疗在中低位直肠癌治疗中的价值已经得到公认，但是约有30%的患者对放化疗不敏感，因此，寻找预测放化疗敏感性的指标成为研究的新热点。近期研究认为肿瘤低氧不仅与肿瘤的侵袭表型相关，还可导致肿瘤细胞对放射线敏感性降低，并促进多药耐药基因表达，使肿瘤细胞产生放化疗抵抗[1-2]。低氧诱导因子1-α（hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α）是唯一的特异性低氧状态下发挥活性的转录因子，环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是HIF-1α的下游调控基因。本研究探讨直肠癌中HIF-1α及COX-2的表达水平对新辅助放化疗敏感性的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集本院2008年4月至2013年3月局部进展期直肠癌患者行新辅助放化疗前的活检标本45例，男31例，女14例，年龄41～69岁，平均（59.9±7.8）岁。肿瘤下缘距离肛门2～8 cm。根据美国癌症联合委员会（AJCC）/国际抗癌联盟（UICC）结直肠癌TNM分期系统（第七版）进行临床T和N分期，采用3.0T MRI进行评估。TNM II期22例，TNM III期23例。T3 34例，T4 11例。患者均接受术前新辅助放化疗并签署知情同意书。本研究得到本院伦理委员会同意。

1.2 治疗方法 新辅助放化疗方案为卡培他滨825 mg/m2，每天2次，连续服用2周休息1周，共2个疗程。放射治疗采用标准的盆腔野照射，Dt 50 Gy/25次，照射野包括肿瘤原发灶和区域淋巴结。放疗结束后第6周接受手术治疗。

1.3 试剂和检测方法 一抗HIF-1α和COX-2均购自北京博奥森生物技术有限公司。兔二抗、DAB显色试剂盒均购于北京中杉金桥试剂公司。已知的HIF-1α、COX-2阳性的乳腺癌组织切片为阳性对照。以PBS代替一抗作为阴性对照。切片脱蜡去水，0.1%枸橼酸修复抗原，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育30 min。DAB显色，苏木精复染、脱水、封片。

1.4 免疫组织化学结果判定 HIF-1α按照Birner等[3]采用的方法，以肿瘤细胞胞核或胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞，综合染色强度和阳性细胞占总细胞数的百分比进行半定量处理。染色强度的评分标准：1分：弱染色但强于阴性对照；2分：中度染色；3分：强染色。阳性细胞数占总细胞数的百分比的评分标准：0分：＜l%；1分：l%～lO%；2分：11%～50%；3分：51%～80%；4分：＞81%。上述评分结果两项相加，1～3分为低表达；4～7分为高表达。COX-2结果判定标准同上。同时量化HIF-1α和COX-2的表达水平：选择相同的参数，每个标本于癌巢随机选取5个不重复的视野拍照。利用Imagepro plus 6.0图像分析系统检测每张照片中肿瘤细胞的光密度值，取平均光密度（mean optical density，MOD）作为该例标本的表达水平。

1.5 新辅助放化疗效果评估方法 判断T分期降期：依据术前影像学临床分期，对比病理检查后的T分期，判断是否发生了T分期的改变。手术标本由2位病理科医师检查阅片。肿瘤消退反应的评判标准参照改良Wheeler直肠癌消退分级（modified rectal cancer regression grade，mRCRG）[4]进行评定：mRCRG I级：肉眼见病理特征改变，镜下未见肿瘤细胞或肿瘤细胞癌巢少于5%，可以有黏液池存在，但是不含有肿瘤细胞；mRCRG II级：肉眼见病理特征改变，镜下见肿瘤细胞与纤维组织混合，肿瘤细胞占5%～50%；mRCRG III级：肉眼及镜下未见明显放疗后病理特征改变，肿瘤细胞超过50%，仅有一些类似于普通结缔组织增生的纤维化组织。

1.6 统计学处理方法 所有数据采用SPSS 13．0统计软件进行统计学分析。采用卡方检验及连续校正卡方检验分析HIF-1α和COX-2表达与直肠癌临床特征及新辅助放化疗效果的关系；采用Spearman等级相关分析HIF-1α与COX-2表达的相关性。P＜0．O5为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 治疗结果 45例患者全部完成术前新辅助放化疗。21例患者出现局部放射性皮炎、恶心、呕吐、骨髓抑制等不良反应，经对症治疗好转。36例接受保肛术，9例接受经腹会阴联合切除术。新辅助放化疗后的手术标本镜下可见肿瘤细胞纤维化（见图1）。肿瘤细胞消退达到mRCRG I级14例（占31.1%），mRCRG II级22例（占48.9%），mRCRG III级9例（占20.0%）。术后T分期降期22例（占48.9%），T分期未降期23例（占51.1%），其中3例（占6.7%）出现T分期进展，由T3进展至T4。随访时间9～68个月，平均（28.5±13.5）月，无失访病例，无局部复发病例。远处转移7例，分别为4例肝转移，2例腹膜后淋巴结广泛转移，1例肺转移。

2.2 HIF-1α和COX-2表达与直肠癌临床特征的关系 在新辅助放化疗前直肠癌活检组织标本中HIF-1α表达率为73.3%，表达在肿瘤细胞核和细胞浆（见图2）；COX-2表达率为82.2%，主要表达在肿瘤细胞的细胞浆（见图3）。新辅助放化疗前直肠癌活检标本中COX-2高表达组肿瘤直径≥5 cm的患者占70.8%，高于低表达组（为28.6%），差异有统计学意义（P＜0.05）。性别、年龄、临床T分期、是否远处转移与HIF-1α及COX-2的表达量均无关（P＞0.05）（见表1）。

2.3 HIF-1α和COX-2表达与直肠癌新辅助放化疗效果的关系 新辅助放化疗前直肠癌活检组织中HIF-1α低表达组有50.0%患者在放化疗后肿瘤消退达到mRCRG I级，而高表达组仅有16.0%达到mRCRG I级，差异有统计学意义（P＜0.05）。HIF-1α低表达组在放化疗后T分期降期率为70.0%，高表达组为32.0%，两者相比差异有统计学意义（P＜0.05）。COX-2表达水平与mRCRG肿瘤消退等级及T分期降期无关（均P＞0.05）（见表1）。

图1 新辅助放化疗后少许残留的癌细胞伴纤维组织增生（HE，×200）

图2 HIF-1α在直肠癌组织中的表达（SP法，×400）

图3 COX-2在直肠癌组织中的表达（SP法，×400）

表1 HIF-1α和COX-2表达与直肠癌临床特征及新辅助放化疗疗效的关系

2.4 直肠癌组织中HIF-1α与COX-2表达的相关性采用光密度值量化新辅助放化疗前直肠癌组织中HIF-1α和COX-2的表达水平，Spearman等级相关分析结果显示两者表达呈低度正相关（r=0.36，P=0.015）。

3 讨论

低氧诱导因子1（HIF-1）是肿瘤细胞在低氧环境下激活的主要转录因子，HIF-1α是HIF-l的功能亚基，其调控的下游基因所编码的蛋白功能中，最主要的是对肿瘤血管生成和能量代谢的调控，并通过促进肿瘤血管生成降低放射敏感性[1]。Kaidi等[5]报道了在低氧的结直肠癌细胞中，HIF-1直接与COX-2启动子中位于-506位点的低氧诱导应答元件相结合，促进COX-2的表达，使PGE合成增加。低氧条件下HIF-1与COX-2/PGE2之间存在正反馈环路，COX-2/PGE2上调一旦触动会不断放大HIF-1作用，调节其他HIF-1的靶向基因，同时维持COX-2的高水平，促进肿瘤细胞对低氧的适应，从而促进肿瘤的生存和转移。

研究发现HIF-1α在一系列人类肿瘤中呈高表达，其表达水平随着微环境氧浓度的改变而改变，与头颈部癌、宫颈癌、前列腺癌、胃癌等肿瘤转移能力、对放化疗的抵抗直接相关[1，6]。目前对HIF-1α与直肠癌新辅助放化疗关系的研究较少。已经发表的文献[7]认为放疗前HIF-1α表达水平与放疗后肿瘤退缩程度无关，这与HIF-1α在其他肿瘤放化疗中的研究结果相悖。原因可能在于作者采用的放疗后肿瘤退缩评判标准并不适用于评价直肠癌新辅助放化疗的效果。在评估直肠癌放化疗疗效的研究中，部分学者提出了“近完全缓解”的概念，认为完全缓解和近完全缓解可以获得很好的预后，无病生存率和总生存率都得到提高，这对直肠肿瘤预后的预测和治疗更有指导意义[8-9]。我们采用改良Wheeler体系（mRCRG），以是否达到肿瘤细胞消退95%以上为标准来评判新辅助放化疗的反应性，结果发现HIF-1α的表达高低与放化疗后肿瘤细胞消退程度密切相关，同时HIF-1α的表达水平与肿瘤T分期降期亦密切相关。HIF-1α高表达组新辅助放化疗反应性差，而低表达组可以获得较好的新辅助放化疗反应。原因可能在于HIF-1α调控某些参与DNA修复过程的因子表达，放疗时使电离辐射对肿瘤细胞DNA的损伤无法固定，并通过促进无氧代谢使残留的肿瘤细胞获得必要的生存条件。HIF-1α通过抗凋亡、上调血管内皮生长因子（VEGF），促进肿瘤血管生成而降低放射敏感性[1，10]。

尽管临床前期研究显示选择性COX-2抑制剂能显著增强肿瘤对放疗的反应性[11]，而且体内外试验也都支持这种观点，但是来自人体直肠癌治疗的研究数据仍然较少。我们的研究结果显示COX-2的表达水平与肿瘤消退程度或T分期降期均无关，这与Bouzourene等[12]的研究结果相一致，他们发现COX-2的表达与肿瘤的炎症反应相关，而与放疗敏感性并无相关。Kim等[13]也对包括COX-2和survivin在内的7个分子标志物做了直肠癌新辅助放化疗敏感性预测分析，仅有survivin的高表达与肿瘤降期相关，而包括COX-2在内的其他指标都与降期无关。此外，我们的研究结果也显示HIF-1α和COX-2在直肠癌组织中的表达水平只呈现低度正相关，这或许从另一方面提示在低氧的肿瘤中COX-2虽然是HIF-1α的下游调控基因，但是COX-2与HIF-1α可能通过多个未知的靶点在肿瘤中相互调节，COX-2在直肠癌放化疗的敏感性中扮演更加复杂的角色，需要进一步的研究来深入阐明HIF-1α和COX-2互相作用的内在机制。

综上所述，新辅助治疗前直肠癌组织HIF-1α的表达水平可能成为预测放化疗后肿瘤退缩和T分期降期的敏感性指标。影响直肠癌新辅助放化疗疗效的因素是多方面的，每个因素的变动都有可能对敏感性预测因子的判断产生影响。选用对临床具有指导意义的判断标准，通过严格的临床试验设计，才能最终找到敏感性和特异性好的预测因子。

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