人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞介导放射性碘治疗的实验研究

杜凡，周佰林，张红征，李焕斌，文正伟，王玲，张琦

（温州医科大学 核医学教研室，浙江 温州 325035）

随着DNA重组和基因转移技术的逐步成熟，钠/碘转运体（sodium/iodide symporter，NIS）作为人类肿瘤的一种治疗基因，被广泛地转染到多种肿瘤细胞中，如甲状腺髓样癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌等[1-4]，并成功地使转染的肿瘤细胞具有摄碘功能。扩展碘131（131I）在非甲状腺癌中的治疗是NIS最具前景的研究领域之一。我们设想将转基因技术与放射性核素治疗相结合，将人钠/碘转运体（hNIS）基因转染至人结肠癌SW480细胞中，使SW480细胞获取摄131I能力，然后利用131I的辐射生物效应，达到杀伤肿瘤细胞的目的，即研究131I应用于结肠癌治疗的可能性，为下一步的动物体内实验提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞： SW480细胞购于上海中科院细胞库；已转染空白质粒（pcDNA3.1+）的SW480细胞和已转染hNIS基因（pcDNA3.1+-hNIS）的SW480细胞，由温州医科大学核医学教研室转染并检测[5]。

1.1.2 主要试剂：131I购于中国原子高科有限公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购于凯基生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将细胞分为重组质粒（pcDNA3.1+-hNIS）转染组（转染组）、空白质粒（pcDNA3.1+）转染组（空白质粒组）和空白对照组。以10%血清1640培养基，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，长满培养瓶85%～90%时传代。

1.2.2 体外摄131I实验：①用λ计数器测各组细胞本身的cpm值，即本底值。②6孔板培养各组SW480细胞24 h，每孔加含有15μCi131I的培养基1 mL，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。测24 h的瞬时摄131I率。③6孔板培养各组SW480细胞，分别于4、8、16、24、36、48 h用胰酶消化提取细胞测cpm值。④同时保留一管含有15μCi培养液1 mL，λ计数器测它不同时段的cpm值。测不同时段摄131I能力变化。

1.2.3 高氯酸盐抑制实验：各组SW480细胞均匀接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，长至约80%融合时，其中3个孔加入20μL的l mmol/mL NaClO4，另3个孔不加NaClO4，每孔加入含有15μCi131I的10%血清1640培养基，培养24 h时，消化提取细胞，测cpm值。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况：各组SW480细胞均匀接种于6孔板，37 ℃、5% CO2培养箱中培养，长至约80%融合时，换新培养基，每1 mL含100μCi的131I。各组细胞8、16和24 h用不含EDTA的胰酶消化收集1×105细胞，加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，加5μL Annexin V-FITC/PI混匀后加入5μL Propidum Iodide，混匀。室温下避光反应5～15 mim。流式细胞仪检测观察131I诱导各组细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS12.0统计软件。各组实验数据均采用±s表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 质粒转染SW480细胞24 h摄131I能力 转染组比空白质粒组与空白对照组摄131I能力增加约8倍（P＜0.05），而空白质粒组与空白对照组摄131I能力差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 质粒转染SW480细胞各时段摄131I能力曲线转染组细胞4～24 h摄131I能力呈增高趋势，24 h摄131I达高峰，24～48 h摄131I能力缓慢递减。而空白对照组与空白质粒组各时段摄131I能力未见显著变化。见图1。

表1 质粒转染SW480细胞后24 h摄131I能力（±s，cpm）

表1 质粒转染SW480细胞后24 h摄131I能力（±s，cpm）

与空白对照组比：aP＜0.05；与空白质粒组比：bP＜0.05

组别 每分钟放射性计数转染组 2 915.34±972.91ab空白质粒组 348.44±92.79空白对照组 333.0±100.86

图1 SW480细胞不同时段摄131I能力曲线图

2.3 测定稳定表达hNIS-SW480细胞NaClO4抑制情况 未加NaClO4转染组摄131I能力明显增加，加NaClO4转染组摄131I能力明显受抑制，摄131I能力降低为前者的1/10左右（P＜0.05）。而空白质粒组与空白对照组加与未加NaClO4摄131I能力差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 稳定转染细胞系NaClO4抑制实验（±s，cpm）

表2 稳定转染细胞系NaClO4抑制实验（±s，cpm）

与同组加NaClO4比：aP＜0.05

组别 加NaClO4 未加NaClO4转染组 315.70±66.30 3 304.60±340.60a空白质粒组 336.80±50.60 309.95±33.14空白对照组 310.70±32.05 339.35±51.28

2.4 流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况 使用Annexin V-FITC/PI双染行流式细胞仪检测分析100 μCi131I杀伤下各组细胞凋亡情况，结果显示转染组16 h出现明显的早期凋亡，凋亡率达14.7%；而24 h晚期凋亡显著增加，凋亡率达32.9%，转染组凋亡率显著高于空白质粒组与空白对照组。见图2。

3 讨论

扩展放射性碘在非甲状腺癌中的治疗是NIS最具前景的研究领域。hNIS作为一种肿瘤治疗基因，研究其靶向特异性并作为精确调控的基因载体治疗肿瘤具有一定优势，即为肿瘤治疗开辟新途径。已有研究报道将hNIS基因转染至非甲状腺肿瘤细胞使其成功表达hNIS获得摄取131I的能力，利用131I的放射性生物杀伤作用达到杀伤肿瘤细胞的疗效[6-7]。

本实验检测了hNIS-SW480细胞的摄131I能力和杀伤作用，结果显示筛选稳定hNIS-SW480细胞后其24 h摄131I能力比空白对照组与空白质粒组增高约8倍（P＜0.05），而空白质粒组与空白对照组摄131I能力未见明显变化（P＞0.05），表明转染入hNIS基因的SW480细胞具有高度浓聚碘的能力。高氯酸盐和碘离子均易被hNIS转运至细胞内，而前者更易被摄取，故给予细胞高氯酸盐能竞争性地将碘离子排出细胞外。但在正常甲状腺细胞中碘离子在碘化酶的作用下与甲状腺球蛋白结合转化成碘化甲状腺球蛋白，则不会自细胞被释放。本实验中hNIS-SW480细胞转染了hNIS基因，仅能摄取131I而没有碘化酶基因的作用，所以当高氯酸盐存在时，碘离子会被排出细胞。高氯酸盐抑制实验结果表明hNIS-SW480细胞摄131I能力为hNIS基因的功能；未加NaClO4转染组摄131I能力明显增加，加NaClO4转染组摄131I能力明显受抑制，摄131I能力降低为前者的1/10左右（P＜0.05），而空白质粒组与空白对照组加与未加NaClO4比摄131I能力差异均无统计学意义（P＞0.05），进一步证明NIS的功能是浓聚碘。Annexin V-FITC/PI双染行流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，在100μCi131I杀伤作用下，转染组16 h出现明显的早期凋亡，凋亡率达14.7%；而24 h晚期凋亡显著增加，凋亡率达32.9%，转染组凋亡率显著高于空白质粒组与空白对照组。

综上所述，结肠癌SW480细胞转染hNIS具有显著的摄131I功能，且131I对转染入hNIS基因的SW480细胞具有显著杀伤效果。尽管关于NIS的研究已经取得显著成果，但NIS的靶向作用、表达程度、在肿瘤细胞中的分布等一系列问题还需进一步探索。

图2 3组在100μCi 131I作用下不同时间凋亡率（Q1：坏死细胞；Q2：晚期凋亡细胞；Q3：存活细胞；Q4：早期凋亡细胞）

[1]Shimura H, Haraguchi K, Miyazaki A, et al. Iodide uptake and experimental 131I therapy in transplanted undifferentiated thyroid cancer cells expressing the Na+/I- symporter gene[J]. Endocrinology, 1997, 138(10): 4493-4496.

[2]周泉波, 陈汝福, 李志花, 等. 重组pDC316-MCMV/hNIS真核表达质粒的构建及在肿瘤细胞的功能[J]. 中山大学学报, 2007, 28(4): 383-386, 407

[3]Dohán O, Baloch Z, Bánrévi Z, et al. Rapid communication:predominant intracellular overexpression of the Na(+)/I(-)symporter (NIS) in a large sampling of thyroid cancer cases[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86(6): 2697-2700.

[4]Cengic N, Baker CH, Schutz M, et al. A novel therapeutic strategy for medullary thyroid cancer based on radioiodine therapy following tissue-specifi c sodium iodide symporter gene expression[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2005,90(8): 4457-4464.

[5]周佰林, 张琦, 张红征, 等. 人钠/碘转运体基因转染结肠癌SW480细胞及相关蛋白表达的检测[J]. 浙江医学, 2013,35(12): 1120-1122, 1126.

[6]Faivre J, Clerc J, Gerolami R, et al. Long-term radioiodine retention and regression of liver cancer after sodium iodide symporter gene transfer in wistar rats[J]. Cancer Res, 2004,64(21): 8045-8051.

[7]Dwyer RM, Bergert ER, O’Connor MK, et al. In vivo radioiodide imaging and treatment of breast cancer xenografts after MUC1-driven expression of the sodium iodide symporter [J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(4): 1483-1489.