ALK-3、Pax-8基因抑制后大鼠心肌细胞中Smad1/5/8的表达

陈德准，吴漪皓，陆圣月，林素，黄晓燕，杨德业，2

（1.温州医科大学附属第一医院 心内科，浙江 温州 325015；2.杭州师范大学附属医院 心内科，浙江 杭州 310015）

Smad蛋白家族是近年新发现的细胞内信号传导蛋白，能够直接参与转化生长因子β（transforming growth factorβ，TGF-β）超家族成员的信号传导。在对果蝇和Caenorhabditiseleg的研究中发现Mad蛋白和Smad蛋白作用于丝氨酸/苏氨酸激酶受体。特异型的Smad蛋白一过性地与受体直接进行配体结合，接受磷酸化后即与受体分离并与Smad4形成复合体，从而转入细胞核，与其他转录协同子和抑制子共同调节靶基因的转录[1-2]。

TGF-β超家族成员骨形态形成蛋白受体IA（bone morphogeneticprotein receptor IA，BMPR-IA），又名ALK-3，在心脏发育和心肌细胞分化中起重要作用。近年来发现ALK-3基因敲除小鼠出现心肌细胞凋亡而导致先天性心脏病，而其下游基因Pax-8在小鼠心脏发育过程中起着重要作用。Smad1/5/8蛋白在ALK-3、Pax-8低表达引起的心肌细胞凋亡中的作用尚未知晓。本研究通过体外研究实验来探索Smad蛋白在基因ALK-3、Pax-8下调中所起的作用。

1 材料和方法

1.1 细胞和试剂 H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌细胞株购买自中科院上海细胞库，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中，在37 ℃，5% CO2孵箱中培养。FBS、0.05%胰酶/EDTA、DMEM/F12、Hanks balanced salt solution购自Gibco；Lipofectamine 2000转染试剂盒、实时定量引物、Trizol试剂、DEPC水（RNase-free and DNase-free）购自美国Invitrogen公司；小鼠抗大鼠β-actin、抗大鼠p-Smad1/5/8抗体、HRP偶联兔抗小鼠IgG抗体购自英国Abcam公司；PCR试剂盒（SYBRGreen Real-time PCR Master Mix）、96孔板及封板膜购自ABI公司；PMSF、RIPA、HRP偶联山羊抗兔抗体、BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强型）购自江苏海门碧云天试剂公司；ECL化学发光显色试剂盒、PVDF膜购自美国Millipore公司；RT试剂盒购自加拿大MBI Fermentas公司。酶标仪ECX800购自Bio-TEX；流式细胞仪购自BD公司。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2 siRNA的合成 大鼠ALK-3 siRNA针对ALK-3的mRNA（GenBank Accession No：NM_030849.1）序列上1741-1750位点，经BLAST分析该序列与大鼠其他基因无明显同源性。正义链：5’-CAGGGAGAAA CCACGUUAATT-3’，反义链：5’-UUAACGUGGUUUCUCCCU GTT-3’。大鼠Pax-8 siRNA针对Pax-8的mRNA（GenBank Accession No：NM_031141）序列上1375-1393位点，经BLAST分析该序列与大鼠其他基因无明显同源性。正义链：5’-GGAAGUGAGUAUUCUGGCATT-3’，反义链：5’-UGCCAGAAUACUCACUUCCTG-3’。NC siRNA为随机合成，正义链：5’-UACUCCGAACGUCCACGUTT-3’，反义链：5’-UGUACACGACGGAGCAGTT-3’，与大鼠基因组各基因均无显著同源性；均由上海吉玛公司合成。

1.3 转染条件的选择 以不同剂量荧光标记（由上海吉玛公司标记）NC siRNA，按如下分组转染H9C2（2-1）细胞：空白对照组（仅含5.0μL Lipofectamine 2000）；5.0μL/5.0μL组（将NC siRNA与Lipofcetamin 2000各5.0μL混合）；5.0μL/7.5μL组（将7.5μL NC siRNA与5.0μL Lipofcetamin 2000混合）；7.5μL/7.5μL组（将7.5μL NC siRNA与7.5μL Lipofcetamin 2000混合）。按照以上分组转染细胞，6 h后换成含10% FBS的DMEM/F12培养基继续培养，24 h后采用倒置荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率，选择转染效率最高且细胞毒作用较小的组合进行后续实验。转染荧光显微镜拍照，计数发绿色荧光细胞数及相同视野下细胞总数，转染效率=（绿色荧光细胞数/相同视野普通光镜下细胞总数）×100%。

1.4 实验分组及处理 转染前1 d，制备单细胞悬液，计数后以1×105/孔接种至6孔板。当细胞生长达50%～60%融合，按照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书进行转染。将实验分成4组：①空白对照组；②阴性对照（NC siRNA）组；③Pax-8 siRNA组；④ALK-3 siRNA组。其中NC siRNA组、Pax-8 siRNA组及ALK-3 siRNA组分别给予相应siRNA和Lipofectamine 2000制成的siRNA-脂质体复合物溶液（比例按照上述1.3所测的最优转染效率进行配制），空白对照组给予常规的培养液，未做其他处理。在37 ℃，5% CO2孵箱中培养48 h进行后续实验。

1.5 实时光定量PCR检测ALK-3 mRNA、Pax-8 mRNA的表达 取上述1.4分组转染48 h的细胞，应用Trizol法提取细胞总RNA并经Dase I消化以去除基因组DNA污染。然后应用Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反转录合成cDNA。以上述cDNA为模板进行荧光实时定量PCR。荧光实时定量PCR引物，Pax-8：上游：5’-CGGCAACGCATTGTGGA-3’，下游：5’-GT CCTGGGCTCAGAGATTTGG-3’，ALK-3：上游：5’-GCTACG CAGGACAATAGAAT-3’，下游：5’-ATCTGTTTGGCAATAGTT CG-3’，GAPDH：上游：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，下游：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。再利用ABI 7900 FAST型荧光实时定量PCR仪进行定量检测。PCR条件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，共40个循环，以GAPDH作为内参，进行归一化，各组生物学重复三次。数据分析利用美国Biosystems公司的Sequence Detec-tionsystem（SDS）2.4软件进行。样本目的基因的相对表达率（relativeexpression，RQ）采用△△CT方法计算，RQ=2-△△CT（CT表示PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数），△CTsample=CTsample-CT/GAPDHsample，△CTcontrol=CTcontrol-CT/GAPDHcontrol，△△CT=△CTsample-△CTcontrol。

1.6 Western blot法检测转染后p-Smad1/5/8和Caspase-3蛋白表达 细胞转染48 h后，用RIPA裂解细胞并提取总蛋白，应用BCA法测定蛋白浓度，各组上样蛋白质50μg，然后进行电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h。一抗（p-Smad1/5/8 antibody 1:1 000，Caspase-3 antibody 1:1 000），4 ℃孵育过夜，TBST溶液洗膜3次，每次5～10 min。室温下加入IgG抗体（1:1 000）孵育1.5 h，洗膜3次，每次5～10 min，应用ECL发光并用DNR进行条带扫描，以β-actin作为内参标化p-Smad1/5/8和Caspase-3蛋白质表达，各组技术、生物学各重复3次。用QuantityOne凝胶成像分析系统对条带进行半定量分析。

1.7 统计学处理方法 采用SPSS 17.0统计软件。计量资料以±s表示，实验数据经过方差齐性检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，独立的两组间比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 荧光显微镜检测转染效率 转染NC siRNA，通过检测发绿色荧光细胞数与同一视野下普通光镜细胞总数的比率，测定转染效率平均约为70%。见图1。

图1 荧光显微镜下细胞图（×100）

2.2 流式细胞仪检测细胞转染效率 空白对照组为0.25%，5.0μL/5.0μL组为67.05%，5.0μL/7.5 μL组为67.60%，7.5μL/7.5μL组为69.20%。在显微镜下观察细胞，获得贴壁多、漂浮少的组别。综合2.1结果及流式细胞计量术的结果，最后选择siRNA5.0μL和Lipofectamine 2000 5.0μL（即5.0μL/5.0μL组）作为最优转染条件。见图2。

2.3 qRT-PCR法检测转染Pax-8 siRNA、ALK-3 siRNA表达靶基因的表达情况 与空白对照组（1.00±0.00）相比，Pax-8 siRNA组（0.46±0.06）Pax-8 mRNA表达下调54%（P＜0.05），ALK-3 siRNA组（0.47±0.07）ALK-3 mRNA表达下调53%（P＜0.05）；与NC siRNA组（0.96±0.12）相比，Pax-8 siRNA组（0.46±0.06）Pax-8 mRNA表达下调50%（P＜0.05），ALK-3 siRNA组（0.47±0.07）ALK-3 mRNA表达下调49%（P＜0.05）；而空白对照组和NC siRNA组mRNA表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.4 Western blot法检测p-Smad1/5/8蛋白和Caspase-3蛋白表达水平 ALK-3 siRNA组（0.45±0.05）与空白对照组（1.00±0.00）、NC siRNA组（1.03±0.16）相比，p-Smad1/5/8的蛋白表达量明显下调（P＜0.05）；Pax-8 siRNA组（1.04±0.15）与空白对照组（1.00±0.00）、NC siRNA组（1.03±0.16）相比，p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计意义（P＞0.05）；而空白对照组和NC siRNA组相比，p-Smad1/5/8的蛋白表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。Pax-8 siRNA组（1.81±0.14）与空白对照组（1.00±0.00）、NC siRNA组（1.05±0.10）相比，Caspase-3蛋白表达量明显上调（P＜0.05）；ALK-3 siRNA组（2.4±0.17）与空白对照组（1.00±0.00）、NC siRNA组（1.05±0.10）相比，Caspase-3的蛋白表达量明显上调（P＜0.05）；而空白对照组和NC siRNA组相比，Caspase-3蛋白表达量差异无统计学意义（P＜0.05）。见图4-5。

图2 流式细胞计量术检测转染效率

图3 实时定量检测siRNA干扰效率

图4 siRNA干扰后对p-Smad1/5/8表达的影响

图5 siRNA干扰后对Caspase-3表达的影响

3 讨论

根据其结构和功能可以将Smad蛋白家族分3类：第1类R-Smads（R-activated Smads），又称为受体调节的Smad，其中包括Smad1、2、3、5、8，第2类Co-Smads（common mediator Smads），又称为协同Smad，哺乳动物中为Smad4，第3类I-Smad（Inhibitory Smads），又称为抑制性Smad，包括Smad6、7。Smad1/5/8蛋白与被激活的丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，通过其MH2结构域，与共同介导的Smad4相互作用，形成异聚体，然后进入细胞核内，直接与目的基因启动子相结合，最后影响基因表达[3-4]。Smad蛋白是唯一知道的能接受TGF-β信号受体丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白底物[5]，又称为通路特异型信号蛋白。另外，除了C-末端的磷酸化位点外，Smad蛋白还有一个区域连接MH1和MH2，包含有4个保守的MAPK磷酸化位点，可被MAPK家族中的ERK、p38、JNK等识别[6]。近期研究表明，TGF-β可以诱导Smad1/5/8的信号，即骨形成蛋白可以激活Smad1/5/8，使之发生磷酸化[7-8]。

TGF-β信号转导通路调控细胞分化、增殖和凋亡，在细胞发展过程中起重要的作用[9]。TGF-β超家族成员BMPR-IA（ALK-3），在心脏发育和心肌细胞分化中起重要作用[10-12]。本课题组发现ALK-3基因在调控心脏发育和心肌细胞凋亡中起着重要作用，特异性敲除ALK-3基因可引起心肌细胞凋亡增多，从而出现室间隔缺损。倪秋明等[13]利用心脏特异性ALK-3敲除纯合子小鼠筛选出ALK-3下游基因转录因子Pax-8，发现Pax-8在敲除基因ALK-3的纯合子小鼠胚胎心脏中下调了7.1倍，并特异地表达在纯合子小鼠胚胎心脏中。高瞻等[14]在大鼠心肌细胞中利用siRNA对基因Pax-8进行干扰，结果发现心肌细胞凋亡增多，细胞增殖受抑制。但基因ALK-3通过何种途径对基因Pax-8进行调控，R-Smad蛋白在其中起何种角色，以及特异性敲除ALK-3后发生细胞凋亡增多的机制尚不明确。本实验通过建立H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌细胞株基因ALK-3和基因Pax-8干扰模型，通过荧光显微镜和流式细胞技术确定转染效率，利用qRT-PCR分别检测其mRNA表达，确定干扰效率。通过Western blot法对p-Smad1/5/8蛋白、Caspase-3蛋白表达进行检测。结果发现在对基因ALK-3进行干扰后，与空白对照组、NC siRNA组相比，出现p-Smad1/5/8蛋白表达下降，细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高，而在对基因Pax-8进行干扰后，与空白对照组、NC siRNA组相比，同样出现细胞凋亡蛋白Caspase-3表达升高，但p-Smad1/5/8蛋白表达改变差异无统计学意义。综上所述，特异性干扰基因ALK-3、Pax-8的表达后可以引起大鼠心肌中细胞凋亡蛋白Caspase-3增多，并且在基因ALK-3干扰组出现明显的Smad1/5/8蛋白磷酸化减少，而同样对基因Pax-8进行干扰后却未出现Caspase-3表达增多，提示Smad1/5/8是基因ALK-3对其下游基因Pax-8进行调控的重要蛋白，表明Smad1/5/8蛋白在接受ALK-3基因的信号转导及其功能表达中起重要作用。

[1]Ten Dijke P, Hill CS. New insights into TGF-beta-Smad signaling[J]. Trends Biochem Sci, 2004, 29(5): 265-273.

[2]Ten Dijke P, Goumans MJ, Itoh F, et al. Regulation of cell proliferation by Smad proteins[J]. J Cell Physiol, 2002,191(1): 1-16.

[3]Whitman M. Smads and early developmental signaling by the TGF-beta superfamily[J]. Genes Dev, 1998, 12(16):2245-2262.

[4]Shi Y, Massague J. Mechanisms of TGF-beta Signaling from Cell Membrane to the Nucleus[J]. Cell, 2003, 113(6): 685-700.

[5]Kingsley DM. The TGF-beta superfamily: new members, new receptors and new genetic tests of function in different organisms[J]. Genes Dev, 1994, 8(2): 133-146.

[6]Li Z, Fei T, Zhang J, et al. BMP4 signaling acts via dualspecifi city phosphatase 9 to control ERK activity in mouse embryonic stem cells[J]. Cell stem cell, 2012, 10(2): 171-182.

[7]Daly AC, Randall RA, Hill CS. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth[J]. Mol Cell Biol, 2008,28(22): 6889-6902.

[8]Wrighton KH, Lin X, Yu PB, et al. TGF-beta can stimulate Smad1 phosphorylation independently of BMP receptors[J].J Biol Chem, 2009, 284(15): 9755-9763.

[9]Nicklas D, Saiz L. Computational modelling of Smad-mediated negative feedback and crosstalk in the TGF-beta superfamily network[J]. J R Soc Interface, 2013, 10(86): 201-363.[10]Schlange T, Andree B, Arnold HH, et al. BMP2 is required for early heart development during a distinct time period[J].Mech Dev, 2000, 91(1-2): 259-270.

[11]Monzen K, Shiojima I, Hiroi Y, et al. Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activate protein kinase kinase kinase TAK 1 and cardiac transcription factors Csx/NKx-2.5 and GATA-4[J].Mol Cell Biol, 1999, 19(10): 7096-7105.

[12]Beppu H, Kawabata M, Hamamoto T, et al. BMP type II receptor is required for gastrulation and early development of mouse embryos[J]. Dev Biol, 2000, 221(1): 249-258.

[13]倪秋明, 章佳颖, 来丹丹, 等. Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调[J]. 温州医学院学报, 2009, 39(1): 1-4.

[14]高瞻, 来丹丹, 张敏, 等. Pax-8基因在大鼠心肌细胞凋亡中的作用[J]. 解放军医学杂志, 2009, 34(9): 1082-1084.