CDCP1胞外段基因的克隆及在大肠杆菌中表达

李玲霞，王志巧，罗晓丽，宋丽娜＊，于珊珊，何成彦，赵丽纯，李洪军，赵海丰，武利涛

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林 长春130033；2.吉林大学药学院，吉林 长春130021；3.佳木斯大学第一临床学院，黑龙江 佳木斯154003；4.北京中医药大学东直门医院）

含 CUB 结构域蛋白1（CUB Domain－containing Protein 1，CDCP1）是一种细胞表面糖蛋白。研究证实CDCP1为一种新的干细胞标志物［1］表达失调与多种癌症的发生、发展相关［2－7］。CDCP1为肿瘤辅助诊断及治疗的潜在靶点。鉴于目前国内应用的CDCP1抗体制剂多为国外公司进口，因此研制CDCP1抗体制剂，可满足国内在系统地探讨CDCP1在肿瘤发生发展、免疫诊断和靶向治疗中的需求。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株及菌种与质粒

人肺腺癌细胞株A549由吉林大学中日联谊医院检验科保存、大肠杆菌 DH5α、BL21（DE3）、pGEX－KG由吉林大学中日联谊医院检验科保存。

1.2 主要试剂

Trizol（Invitrogen）、Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、rTaq聚合酶、dNTP、T4连接酶（TaKaRa）、胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒（爱思进生物技术公司）、IPTG、丙烯酰胺、N，N－甲叉双丙烯酰胺（Sigma）。

引物由上海生工合成，引物序列如下：上游引物：5’－CGC GGATCC ATG AGCTGCCCAGACGGAGTCAC－3’；下游引物：5’－CG GAATTC TCA AGACATCAGGGTTGCTGAGC－3’。

1.3 实验方法

1.3.1总RNA的提取 按Trizol试剂说明提取肺癌细胞系A549总RNA，测定RNA含量及260 nm和280nm的吸收值的比值。

1.3.2cDNA第一条链的合成 按Takara的Cloned AMV First－Strand cDNA Synthesis Kit操作步骤完成。

1.3.3PCR反应 取cDNA 反应液1μl，加入0.5 ml PCR管中，分别加入2mmol／L dNTP 4μl，10×PCR缓冲液5μl，上、下游引物各1μl（10.0pmol／μl），Taq酶2.5U，加DEPC水至终体积50μl，反应条件为94℃变性1min，57℃退火45s，72℃延伸1 min，32个循环后72℃延伸5min。取9μl PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在图像分析处理系统上观察、记录电泳结果。

1.3.4表达载体的构建 碱性裂解法小量制备质粒；酶切反应混合物经震荡混匀、孵育后得到的产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化回收酶切产物并将产物进行琼脂糖凝胶电泳；将连接反应混合物震荡混匀，连接过夜；制备转化的感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养基表面，放于37℃培养。

1.3.5重组克隆的筛选和鉴定 通过双酶切及PCR鉴定确认阳性的克隆，进行基因序列测定。测序结果在NCBI Human RefSeq数据库进行BLAST比对，查看所克隆序列是否为目的序列，是否有缺失或者突变。

1.3.6GST－CDCP1 融合蛋白在大肠杆菌中诱导表达 将pGEX－KG／CDCP1转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态中，经氨苄青霉素筛选转化后菌落，挑取不同单克隆小量培养，提取质粒双酶切鉴定。诱导表达前一天将pGEX－KG／CDCP1重组菌（BL21）培养过夜，留1ml菌液做为阴性对照，剩余培养液中加入IPTG诱导表达，离心后将沉淀悬于Tris缓冲液中；取上述制备的悬液与上样缓冲液混匀，加热离心后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，染色，洗脱，直至观察到清晰的条带。

2 结果

2.1 CDCP1基因的扩增

以肺腺癌细胞株A549的mRNA为模板，应用所设计的引物通过RT－PCR法扩增CDCP1胞外段基因目的片段。琼脂糖凝胶电泳结果显示：在约270bp处扩增出单一条带，大小与预计相符，见图1。

2.2 重组质粒pGEX－KG／cdcp1的筛选及鉴定

将PCR产物经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后，定向插入同样经双酶切的pGEX－KG载体中，获得重组质粒pGEX－KG／CDCP1。经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、PCR及DNA序列测定对重组质粒进行鉴定，筛选出与GST之间读码框架正确的重组质粒，酶切鉴定、PCR鉴定见图2、图3。

图1 RT－PCR扩增CDCP1基因目的片段

图2 重组质粒pGEX－KG／CDCP1的酶切鉴定

图3 重组质粒pGEX－KG／CDCP1的PCR鉴定

2.3 融合蛋白GST－CDCP1在大肠杆菌中的诱导表达

含PGEX－KG／CDCP1重组子的BL21用IPTG诱导表达6h后，SDS－PAGE分析可见，与诱导前相比，在相对分子质量约35kD处出现明显的诱导蛋白条带，分子质量大小与预期一致，见图4。

3 讨论

CDCP1是一种细胞跨膜糖蛋白。CDCP1表达失调与多种肿瘤相关［8］。有研究比较了结肠腺癌和邻近正常组织，发现结肠癌细胞的恶性度与CDCP1染色强度相关［9］。在一项肾细胞癌研究中也观察到，正常肾脏细胞未检测到CDCP1表达，而33.5%癌症病例检测到CDCP1的表达，而且CDCP1的表达与肿瘤分期、组织学分级和转移等进展性疾病指标显著相关。到目前为止有关CDCP1在肿瘤细胞中的功能了解较少，但可明确其为上皮来源肿瘤抗原，并为高转移性表皮样癌的肿瘤相关蛋白。CDCP1在细胞与细胞之间及细胞与细胞基质间黏附中起重要作用。CDCP1通过与细胞内多种蛋白质相互作用而发挥其生物学作用，但目前还了解较少。能力的生物学特征了解的很少。而在正常的肺［10］、结肠［11］、睾丸等组织中检测到CDCP1低水平表达。CDCP1也是白血病细胞［12］、骨髓和间充质干／祖细胞和神经祖细胞［10］。

图4 SDS－PAGE分析融合蛋白GST－CDCP1的表达

鉴于CDCP1为一种肿瘤相关抗原，且为跨膜蛋白，CDCP1是肿瘤诊断与治疗的较理想的靶点［13］。最近应用基因工程抗CDCP1发现，靶向CDCP1阻断肿瘤发展。在体外，该抗体阻断前列腺癌PC－3细胞的迁移和侵袭［4］。

目前有关CDCP1在肿瘤发生发展作用及CDCP1信号传导系统的研究较少。因此研制新型、价格适宜的CDCP1抗体有助于促进国内进行更广泛深入的有关CDCP1生物学作用的研究。

本研究构建的重组质粒pGEX－K／CDCP1转化大肠杆菌后经IPTG诱导获得高效表达。下一步将通过亲和层析纯化CDCP1－GST融合蛋白，经免疫印记鉴定后免疫动物制备多克隆抗体，并通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体，抗体经初步纯化，选择肺癌、结肠癌等组织标本和血液标本进行抗体特异性鉴定。

综上所述，我们成功克隆了CDCP1胞外段基因序列并构建了pGEX－KG／CDCP1原核表达载体。本研究工作，为CDCP1抗体的制备奠定实验基础。

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