阴沟肠杆菌AcrAB－TolC外排系统基因研究

温见翔，陈 娟，杨 虹

（北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳518036）

阴沟肠杆菌是临床常见的条件致病菌之一，亦是医院获得性感染的重要病原菌［1］。近年来，随着广谱抗菌药物的广泛使用，阴沟肠杆菌在抗生素的选择性压力下出现高耐药性和多重耐药。阴沟肠杆菌感染已成为医院感染的重要致病菌之一。我院阴沟肠杆菌感染分布与耐药状况亦不容乐观［2］，本研究通过检测我院临床分离的141株阴沟肠杆菌AcrAB－TolC外排系统acrA，acrB，tolC和acrR 4种基因，分析4种基因的携带分布，研究AcrAB－TolC外排系统基因与阴沟肠杆菌耐药性之间的关系。

1 材料与方法

1.1菌株鉴定与药敏试验2010年5月至2013年6月从北京大学深圳医院门急诊及住院部患者痰液、尿液、血液、脓液、胆汁等标本分离到的阴沟肠杆菌共计141株。所有菌株经 MicroScanWalkaway40细菌分析仪进行鉴定和药敏试验，测其对各种抗生素的最小抑菌浓度（MIC）。同一患者同一部位分离出的阴沟肠杆菌，如药敏结果相同，仅采用首次分离菌株。以大肠杆菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC27853为质控菌株，药敏结果依据CLSI2013年执行标准判定。

1.2仪器与试剂美国德灵公司生产的 MicroScanWalkaway40型全自动细菌分析系统及该公司提供的阴性菌复合板；PCR扩增仪为美国Biosytems公司产品；凝胶成像系统为美国BIO－RAD公司产品质；标准分子量DNA、Taq DNA聚合酶、pMD18－T载体、DNA胶回收试剂盒为TAKARA公司产品。

1.3AcrAB－TolC外排系统基因的扩增根据AcrAB－TolC外排系统acrA，acrB，acrR和tolC 4种基因序列，设计PCR引物，并由TAKARA公司合成引物，引物序列及产物长度见表1。采用煮沸法提取各株阴沟肠杆菌基因组的DNA，进行PCR扩增。四种基因的PCR反应总体积均为50μl（DNA聚合酶系统Premix Taq9.5μl，上游引物及下游引物各1μl，DNA模板2μl，去离子水36.5μl）。基因扩增反应条件分别为：acrA基因94℃预变性4min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃终末延伸5min；acrB基因94℃预变性4min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延伸3min，共40个循环，72℃终末延伸5min；acrR基因94℃预变性4min，95℃变性30s，48℃退火30 s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃终末延伸5 min；tolC基因94℃预变性4min，95℃变性30s，43℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，72℃终末延伸5min。PCR产物在含0.5mg／L溴化乙啶的1%琼脂糖凝胶中电泳30min，使用BIO－RAD凝胶成像系统观察结果，分析PCR产物。

1.4扩增产物的纯化、克隆与测序PCR扩增产物经凝胶回收试剂盒回收并纯化，将其与pMD－18T载体连接，连接产物转化入感受态大肠杆菌E coli JM109中，用含氨苄西林的LB平板筛选含阳性质粒的菌落，阳性菌经扩增培养后送TAKARA公司进行测序。

1.5统计学分析采用SPSS 17.0统计软件对结果进行卡方检验。

表1 靶基因引物识别序列及目的产物长度

2 结果

2.1药敏试验结果141株阴沟肠杆菌对常见抗菌药物的药敏试验结果见表2。根据耐药表型不同，将141株阴沟肠杆菌分为4组见表3。

表2 141株阴沟肠杆菌对常见抗菌药物的药敏试验结果

表3 141株阴沟肠杆菌耐药表型分组

2.2AcrAB－TolC外排系统基因扩增及测序结果acrA，acrB，acrR和tolC 4种基因在141株阴沟肠杆菌中均扩增出阳性株，其PCR扩增电泳结果见图1、图2、图3和图4。4种基因PCR产物经克隆后测序，测序 结 果 与 （CNBI）Genbank 数 据 库 （http：／／www.cnbi.nim.nih.gov BLAST 程序）进行对比，同源性比对后证实，4种基因与阴沟肠杆菌同源性均为96%。

图1 acrA基因PCR扩增电泳图

图2 acrB基因PCR扩增电泳图

图3 acrR基因PCR扩增电泳图

图4 tolC基因PCR扩增电泳图

2.3统计学分析结果141株阴沟肠杆菌分别扩增出139株acrA基因阳性株，阳性率为98.58%；72株acrB基因阳性株，阳性率为51.06%；111株acrR基因阳性株，阳性率为78.72%；116株tolC基因阳性株，阳性率为82.27%，4种基因的阳性率差异有统计学意义（P＜0.01），见表4。分别比较多重耐药组、双重耐药组、单重耐药组和敏感组不同基因的阳性率，acrA基因和acrB基因在4组菌株的阳性率差异均具有统计学意义（P＜0.01），而AcrR基因和tolC基因的阳性率组间无统计学差异，见表5。

表4 4种基因阳性率的比较

表5 四种基因在不同组中阳性率的比较

3 讨论

主动外排系统是引起细菌多重耐药的机制之一，作为一种非特异性耐药机制，可引起细菌固有的耐药性［3，4］，而耐药结节细胞分化家族 AcrAB－TolC外排系统是导致革兰阴性菌多重耐药性的重要因素［5－7］。阴沟肠杆菌染色体上存在acrA，acrB，acrR和tolC基因，可以编码AcrAB－TolC外排泵，多重耐药的阴沟肠杆菌存在活跃的AcrAB－To1C外排泵［8］，阴沟肠杆菌多重耐药与主动外排系统有关。

本研究结果显示，141株阴沟肠杆菌高水平携带AcrAB－TolC系统的acrA，acrB，acrR和tolC四种基因，其中acrA基因的阳性检出率最高，acrB基因的阳性检出率最低，四种基因的阳性检出率有显著的差异（P＜0.01）。根据耐药表型的不同，将141株阴沟肠杆菌分为多重耐药组、双重耐药组、单重耐药组和敏感组，比较各组阴沟肠杆菌不同基因的阳性检出率，acrA基因和acrB基因在不同组的阳性率有显著性差异（P＜0.01），各耐药组高于敏感组，且多重耐药组阳性率最高；acrR基因和tolC基因在不同组的阳性率无显著性差异。

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