肿瘤酸性pH分子显像研究进展

胡 鸿, 唐刚华，胡孔珍

(1.人民医院 放射科，湖南 东安 425900；2.中山大学附属第一医院 核医学科PET-CT中心，广州 510080)

人体体液保持着严格的酸碱平衡[1]。体液中含量最多的碳酸氢盐/二氧化碳(HCO3-/CO2)缓冲体系在维持体液酸碱动态平衡中起着重要的作用。细胞外液主要缓冲物质为HCO3-(NaHCO3)，在碳酸酐酶作用下，体内HCO3-和CO2发生相互转化，能够调节缓冲体液微弱酸碱变化，从而维持体内酸碱动态平衡[2-3]。

许多疾病状态诸如炎症、缺血、癌症和肾脏疾病等都涉及pH变化(酸碱失衡)。研究表明，几乎所有肿瘤细胞内液pHi(7.0～7.2)和肿瘤细胞外液pHe(6.2～6.9)都低于正常组织(pH 7.3～7.4)[1，4-6]，组织细胞pH变化是代谢过程、质子转运和缓冲作用的综合结果[1]，测定体液pH可为酸碱失衡引起的疾病提供参考，肿瘤pH显像是分子显像重要研究领域。近年来，磁共振显像(MRI)、磁共振波谱分析(MRS)、核医学显像和光学成像已用于临床前pH显像研究，在涉及酸碱失衡的诊断和疗效监测方面具有较好应用前景，为进一步将无创伤性显像技术转化为临床肿瘤pH分子显像奠定了基础。本文对肿瘤酸性pH分子显像最新研究进展进行综述。

1 pH分子探针

理想的pH分子探针应符合以下条件[7]：(1)能够部分电离，即以离子化形式和非电离形式存在，离子化形式浓度和非电离形式浓度比值([离子化形式]/[非电离形式])与pH成比例，满足Henderson-Hasselbalch方程：pH=pKa+lg([离子化形式]/[非电离形式])，其中pKa为酸电离常数Ka的负对数；(2) 分子探针不会改变组织pH变化；(3) pH分子探针组织区室化分布已知；(4) 分子探针为无毒；(5)不依赖分子探针浓度；(6)快速检测pH变化。pH分子探针主要包括磁共振分子显像(MRMI)探针、核医学分子显像探针和光学分子显像探针，其他方面的影像分子探针应用较少。

1.1 pH磁共振分子显像探针

用于检测pH的磁共振分子显像(MRMI) 探针较多，包括磁共振波谱(MRS)分子探针和磁共振显像(MRI)造影剂。检测pH的MRS分子探针一般是基于依赖和非依赖pH共振间化学位移变化的原理而设计，分为MRS探针和MRS显像(MRSI)探针。近年来报道较多的MRS探针有：3-[N-(4-氟-2-三氟甲基-苯基)-磺酰基]-丙酸(ZK-150471)，用于19F-MRS检测细胞外pH (pHe)[8]；无机磷酸盐(Pi)，用于31P-MRS检测细胞内pH(pHi)[8]；3-氨基磷酸丙酯(3-APP)，用于31P-MRS检测pHe[7-8]。1H MRSI探针 (±)2-(咪唑-1-基)-丁二酸 (ISUCA)和(±)2-咪唑-1-基-3-乙氧羰基丙酸(IEPA)的应用，可提高31P和19F检测pHe的灵敏性，但其空间和时间分辨率仍有限[1,8]。

目前，MRMI探针主要发展为三大类：动态核极化(DNP) MRS/MRSI探针、驰豫MRI探针和化学交换饱和转移(CEST) MRI探针，常用MRMI探针列于表1。 DNP能显著提高MRS的灵敏度，该技术是基于微波轰击样品，将不成对电子极性转化为邻近核极性，以提高MRS信号强度[1]。目前，主要的DNP 探针有：89Y-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基- N,N′,N″,N‴-四(甲叉磷酸)(89Y-DOTP)，用于DNP89Y-MRS检测pHe[7]；超极化13C-标记碳酸氢盐，用于DNP13C-MRS/MRSI检测pHe和pHi[2,7-8]；1-13C-丙酮酸盐(Pyruvate)，用于DNP MRSI检测心肌细胞内pHi[7,9]。驰豫MRI是通过pH依赖性驰豫剂扰动水的弛豫，实现对pH显像。驰豫MRI探针报道较少，如157Gd-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-1,4,7,10-四乙酰胺基-四磷酸酯(Gd-DOTA-4AmP5-)和163Dy-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-N,N′,N″,N‴-四(甲叉磷酸，Dy-DOTP)联合应用，可检测pHe[7-8]。CEST MRI与传统造影剂不同，可通过转移饱和质子达到减低水分子信号(T1和T2*)而产生阴性对比，主要分为以下三类。 早期使用的小分子如糖类、氨基酸类、铵离子、杂环化合物等探针，属于反磁性CEST (diaCEST) 探针，如碘帕醇(Iopamidol)[10]和碘普胺(Iopromide)[11]；而使用镧系元素合成的173Yb-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基-1,4,7,10-四乙酸, 10-邻氨基苯胺(Yb-DO3A-oAA)[1]等，为顺磁性CEST (paraCEST)探针；对体内微量的蛋白质、多肽CEST 成像，这些内源性可变蛋白质和多肽则成为酰胺质子转移(APT)[12]MRI探针。

表1 检测pH的MRMI 探针

续表

1.2 pH核医学分子探针

用于检测pH的核医学分子探针，包括正电子发射断层(PET)显像分子探针和单光子发射断层(SPECT)显像分子探针。吸入11CO2[13]或注射[2-11C]5,5-二甲基噁唑烷-2,4-二酮(DMO)[14]已初步用于临床PET检测pH。两种pH分子探针检测pH的原理是基于探针离子化形式浓度和非电离形式浓度比值([离子化形式]/[非电离形式])与pH成比例。但由于吸入11CO2操作较麻烦，DMO合成较困难，且其灵敏度有限，因而限制了临床[7]。最近，国外研究者研制了一种可选择性靶向体内酸性组织的低pH插入肽(pHLIP)，并用64Cu标记pHLIP (64Cu-pHLIP，图1)。在酸性的细胞外环境而不是正常生理pH下，pHLIP主要以单聚α-螺旋形式插入在脂质双分子层中，因而，64Cu-pHLIP PET可用于检测肿瘤pH[1,7,15]。最近，99Tcm标记pHLIP和18F-D-WT-pHLIP(图1)，也已分别用于SPECT 和PET检测肿瘤pH[16]。

1.3 pH光学分子显像探针

检测pH的光学分子探针是光学分子显像重要研究领域，许多光学分子探针已用于肿瘤pH检测。pH光学分子探针的作用机理主要包括：(1)基于光诱导电子转移(PeT)效应[5]，如酸性和碱性媒介中小分子氨基苯基BODIPY探针 (Aminophenyl BODIPY，结构示于图2a)[17]与酸性和碱性媒介中环状小分子精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽-染料探针(Dye-cRGD，结构示于图2b)[18]。质子化的Aminophenyl BODIPY和Dye-cRGD荧光增强，去质子化的Aminophenyl BODIPY和Dye-cRGD几乎无荧光。(2)基于荧光共振能量转移(FRET)效应[5]，如量子点(QD)装配多巴胺和多肽探针(QD-Dopamine-Peptide,结构示于图2c)[19]。在低pH时，主要以氢醌形式存在的QD-Dopamine-Peptide作为差的电子接受体，导致低光致发光淬灭(QD PL)现象。随着pH增加，缓冲液周边氧气氧化多巴胺，生成H2O2和苯醌。以苯醌形式存在的QD-Dopamine-Peptide作为好的电子接受体，引起较高效率的光致发光淬灭现象。(3) 基于自聚集相关能量转移(SAET)效应[5]，如右旋糖苷纳米探针(Dextran-NP，结构示于图2d)[20]。在生理酸性环境中，腙键断裂导致荧光恢复。(4) 基于选择性靶向体内酸性组织脂质双分子层[21]，如荧光基(Cy5.5和Alexa750)标记pHLIP，用于光学显像pH[6,21-23]。近年来，荧光比率显像探针和荧光寿命显像探针已发展成为两类重要的pH光学分子探针，前者基于检测发射光谱，后者基于检测探针寿命[1]。荧光寿命显像探针又分为时域荧光探针和频域荧光探针[1]。荧光比率显像探针的发展是pH光学分子显像的重要选择，如基于无机材料QD的比率纳米探针、基于合成聚合物的比率纳米探针和基于噬菌体的比率纳米探针[5]，但pH荧光寿命显像探针报道相对较少，如QD和绿色荧光蛋白纳米荧光寿命探针。

图1 64Cu-pHLIP 、99Tcm-AH114567和18F-D-WT-pHLIP的结构Fig.1 Structure of 64Cu-pHLIP, 99Tcm-AH114567, and 18F-D-WT-pHLIP

图2 典型pH光学分子探针的结构。a— Aminophenyl BODIPY；b—Dye-cRGD；c—QD-Dopamine-Peptide；d—Dextran-NPFig.2 Typical structure of fluorescent pH probesa—Aminophenyl BODIPY；b—Dye-cRGD；c— QD-Dopamine-Peptide；d—Dextran-NP

2 pH分子显像的应用

2.1 pH磁共振分子显像

检测pH的 MRMI方法分为依赖pH化学位移技术、依赖磁化传递技术和依赖pH驰豫技术。早期使用的依赖pH化学位移技术主要包括1H、31P、19F和89Y MRS/MRSI。31P-MRS利用内源性Pi化学位移可检出pHi，同时利用外源性3-APP化学位移可检出pHe[1]。利用维生素B6氟化衍生物，19F-MRS可检出pHe和pHi[7]。由于这些探针具有低灵敏度，因而MRS很难获得高分辨率的pH图谱。为进一步提高其检测灵敏度，利用IEPA的pH敏感H2磁共振波谱分析共振可改善1H-MRS检测肿瘤(如乳腺癌和脑瘤)pH灵敏度[1,7,24]。尽管这些方法可检出肿瘤pHe，但其时间和空间分辨率仍有限。

动态核极化(DNP)是依赖pH化学位移技术，可显著提高MRI灵敏度[2,25]。利用超极化13C标记探针和89Y标记探针的化学位移变化，MRS/MRSI已用于肿瘤pH的检测。超极化1-13C-丙酮酸盐DNP技术已用于检测健康和疾病心脏的pHi[26]，也可监测肿瘤组织代谢变化[27]，但是否可用于肿瘤pH检测，尚无文献报道。Gallagher等[2]报道用超极化13C-标记碳酸氢盐检测肿瘤pH，显示很好应用前景，可望用于临床。荷瘤模型动物体内注射超极化13C-碳酸氢盐后，测定超极化H13CO3-和13CO2信号强度比值，采用Henderson-Hasselbalch方程估算肿瘤组织pH/pHe。结果表明，13C-标记碳酸氢盐DNP技术可望用于涉及肿瘤、缺血和炎症等组织内pH变化的临床病理过程显像。89Y-DOTP已用于DNP89Y-MRS检测pH，可显著提高灵敏度[28]，但尚无活体pH显像研究报道。

化学交换饱和转移(CEST)属于依赖磁化传递技术，采用体相水和探针分子间的磁化传递MRI来评估检测肿瘤组织pH，包括反磁性CEST (diaCEST)、顺磁性CEST(paraCEST)和酰胺质子转移(APT) CEST[1,7]。用Yb-DO3A-oAA paraCEST检测MDA-MB-231乳腺肿瘤组织中pH，可获得乳腺肿瘤组织pH为6.82± 0.21，大腿肌肉pH为 7.26 ±0.14，并可获得MCF乳腺肿瘤pHe图谱[1,29]。Chen等[11]报道了用碘普胺(碘帕醇类似物) diaCEST检测乳腺肿瘤组织pHe，其检测pHe范围为6.2～7.2，经碳酸氢盐治疗后肿瘤pHe≥7.1，该方法为评估肿瘤酸性提供了无创伤性方法。酰胺质子转移(APT)是一种可用于检测组织中内源性可移动蛋白质和多肽酰胺质子的CEST-MRI技术，该法不需要注射造影剂，而是基于内源性物质(探针)。APT MRI在检测模型肿瘤pH方面具有较大潜力，近来Zhou等[12]已将该技术用于人脑肿瘤APT MRI研究，显示较好应用前景。

MR驰豫技术是基于用pH依赖驰豫造影剂扰动水的驰豫进行肿瘤组织pH检测，通常分为单注射法和双注射法。最常用的MR驰豫造影剂为Gd或Dy络合物造影剂，如Gd-DOTA-4AmP5-和Dy-DOTP。Garcia-Martin等[30]采用双注射法，即先后注射pH 敏感的Gd-DOTA-4AmP5-和pH非敏感的Dy-DOTP，对荷脑胶质瘤大鼠的脑瘤组织进行pH MRI显像。Martinez等[31]采用单注射法，共同注射pH 敏感的Gd-DOTA-4AmP5-和pH非敏感的Dy-DOTP，对脑胶质瘤模型进行pH MRI显像。单注射法具有较高空间分辨率，是较实用的临床检测肿瘤pH方法。

2.2 pH核医学分子显像

pH核医学分子显像，包括PET显像和SPECT显像。持续吸入11CO2用于脑瘤病人PET显像，检测脑瘤组织pH，结果显示脑瘤组织有一定程度放射性摄取[13]。但由于吸入11CO2操作较麻烦，且灵敏度不够理想，因而11CO2应用于临床PET显像有限[7]。注射DMO也已初步用于PET检测脑瘤病人脑瘤组织pH[14]，但DMO合成较困难，且不能准确检测pH，因而未被广泛应用于临床PET显像[7]。唐刚华等[32]利用回旋加速器生产的11C-CO2，通过NaOH在柱吸附，用稀盐酸或NaH2PO4缓冲液中和后，即可得11C-碳酸氢盐缓冲液(11C-HCO3-/11C-CO2) 酸碱失衡显像剂，用于各种与酸碱失衡有关疾病(如肿瘤和炎症)的PET显像，可望迅速转化为临床应用。近年来，pHLIP是研究比较热门的多肽，可作为广范肿瘤标志物[6,23]。Vavere等[15]研制了64Cu-pHLIP，用于PET检测前列腺癌组织pHe，结果表明，低pHe前列腺癌组织可高度摄取64Cu-pHLIP，从而为酸性实体瘤的诊断提供了PET分子显像新方法。Daumar等[33]研制了18F-D-WT-pHLIP，用于PET检测前列腺癌组织pHe，获得了与64Cu-pHLIP 相类似的pH PET显像结果。Macholl 等[16]用99Tcm标记pHLIP制备了99Tcm-AH114567，用于SPECT 检测多种肿瘤pH，展现出较好的应用前景。但放射性核素标记pHLIP转化为临床应用仍需要进一步研究。

2.3 pH光学分子显像

pH光学分子显像主要集中基于PeT荧光探针、FRET荧光探针、SAET荧光探针和pHLIP荧光探针的应用。基于PeT的小分子荧光探针Aminophenyl BODIPY，在细胞内可通过溶酶体pH变化而被活化。体内外实验表明， BODIPY荧光探针与靶向肿瘤单克隆抗体的结合物，可特异性靶向结合活的癌细胞。这些结合物可用于肿瘤检测及实时治疗监测，也可为评估细胞内受体动力学、细胞活性和实时细胞死亡监测提供体外工具[17]。另外，靶向整合素小分子近红外pH活化荧光探针Dye-cRGD可用于活体显像来探测原发性和转移性乳腺癌，并具有较高的特异性和灵敏度[18]。基于FRET的QD-Dopamine-Peptide荧光纳米探针已用于检测细胞质中pH变化，但并未见活体肿瘤pH检测的研究报道[19]。基于SAET的荧光纳米探针Dextran-NP，体外光声显像表明，Dextran-NP探针能够区分癌症细胞和正常细胞。另外，活体双波长光声显像表明，Dextran-NP探针能够鉴别模型动物乳腺肿瘤组织和周围正常组织。结果表明，Dextran-NP探针可无创检测在正常生理和酸性环境中的早期肿瘤，并具有较高光学对比度[20]。标记pHLIP用于靶向肿瘤酸性光学显像是近年来研究的热点领域。Andreev等[21]用荧光基(Cy5.5或Alexa750)标记pHLIP，研究了靶向肿瘤酸性组织细胞膜肽的机理和用途，结果表明，荧光标记pHLIP可望用于肿瘤和炎症pH显像。Reshetnyak等[22]用荧光基(Cy5.5或Alexa750)标记pHLIP，对荷瘤模型酸性肿瘤pH行光学显像，结果表明，标记pHLIP可特异地结合转移性肿瘤和非转移性肿瘤组织，为原发性肿瘤、转移性肿瘤和坏死组织脂质体诊断提供新方法。最近，Weerakkody等[23]用荧光标记pHLIP研究了pHLIP靶向肿瘤作用，为进一步研制新型靶向酸性肿瘤pH的pHLIP分子探针提供了实验依据。

荧光比率显像和荧光寿命显像是两类重要的pH光学分子显像方法[1]。目前荧光比率显像应用于肿瘤pH检测报道较多，但主要局限于体外pH检测。由于荧光比率显像是基于荧光强度的测量方法，容易受激发光强度、 样品猝灭和荧光染料的浓度分布等因素的影响，难以做到准确定量测量。而荧光寿命显像一般来说是绝对的, 不受激发光强度、 荧光团浓度和光漂白等因素的影响, 仅与荧光团所处的微环境密切相关。因此，pH荧光寿命显像是pH光学分子显像的重要发展方向，但目前其应用有限。

3 小结

酸性pH是一种通用的肿瘤生物标志物，靶向酸性pH分子探针的研制是目前分子影像学热门研究领域。靶向酸性pH分子探针，已用于肿瘤磁共振分子显像、核医学显像和光学显像。用于靶向酸性pH磁共振分子显像探针研究较多，但用于临床肿瘤显像的研究报道很有限。近年来，pH核医学显像发展较快，但具有较好临床应用前景的pH探针很少。用于光学显像的pH分子探针也有较多报道，但主要集中在临床前研究阶段。用于超声显像的pH分子探针尚未发现文献报道。

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