99Tcm标记DPZM类右旋糖苷衍生物的淋巴结摄取

李洪玉，梁积新，杨春慧，罗洪义，庄 玲，陈 阳，孙桂全，郑德强

(1.中国原子能科学研究院 同位素研究所 北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.中国核工业北京401医院，北京 102413)

早期诊断是控制癌症的关键手段之一。尽早发现局部淋巴结转移灶对肿瘤的临床分期、治疗方案均有极大的意义。前哨淋巴结(SLN)是接受原发肿瘤淋巴回流的第一个或第一组淋巴结，是最早可能发生肿瘤转移的特异淋巴结。前哨淋巴结活检(SLNB)是指获取前哨淋巴结并进行病理学检查的技术手段。采用影像学手段准确定位SLN，对于癌症的诊断和治疗具有重要意义[1-2]，而SLN的成功检出率很大程度上取决于显像剂的选择。目前临床上最常用的SLN显像剂有99Tcm-硫化锑胶体、99Tcm-硫胶体、99Tcm-人血清白蛋白、99Tcm-右旋糖苷等，但颗粒大小不均，每次注入颗粒总数不易控制。对显像及活检时间要求严格，在注射点高浓集，且大多是非特异性显像剂，放射性易从SLN向次级淋巴结(2LN)迁移并使次级淋巴结显像[3-5]。

研究表明[5-7]，右旋糖苷分子骨架，可修饰不同的化学基团而表现出不同的分子性质，另外还具有水溶性较好、低毒性、低免疫原性、在血液中不易降解等优点。99Tcm标记的甘露糖基化的右旋糖苷可与淋巴结巨噬细胞表面的受体结合，且其分子大小较为确定，体内分布性能较好，在SLN显像方面具有可观的应用前景。LymphoseekTM(99Tcm-tilmanocept，99Tcm-DTPA-甘露糖基右旋糖苷)作为一种具有受体结合性质的右旋糖苷显像剂被用于SLN检测，目前已被美国FDA批准上市[8]。

本研究拟用99Tcm标记连接有吡唑二胺基团的甘露糖基化的右旋糖苷衍生物(Dextran-amine-pyrazole-mannose，DPZM)类化合物，该类化合物可通过两个氨基及吡唑环上的氮原子以NNN键与羰基锝进行螯合，形成稳定的配合物99Tcm-(CO)3-DPZM[9]，并对99Tcm-(CO)3-DPZM的生物分布和显像以及不同注射剂量对正常鼠淋巴结摄取及体内分布的影响进行研究。

1 实验材料

1.1 主要仪器

99Mo-99Tcm发生器：原子高科股份有限公司产品；FH463A自动定标器、FT-603型闪烁探头：北京核仪器厂；CRC 15R放射性活度计：美国CAPINTEC公司；微量注射器：美国 Hamilton公司；高效液相系统：ProStar 210型，美国Varian公司；HPLC放射性检测器：德国Raytest公司；Milli-Q高纯水制备系统：MILLIPORE公司。

1.2 主要试剂

Isolink药盒：由Mallinckrodt-Tyco公司生产并赠送；右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8：由葡萄牙里斯本技术大学化学系的Isabel Rego Dos Santos教授提供；其他实验所用试剂均为国产分析纯，实验用水均为去离子纯化水。

1.3 实验动物

BALB/c小白鼠：30 只，随机分组，每组5 只，雌雄兼用，18～22 g；Wistar大鼠：50 只，随机分组，每组3～5只，雌雄兼用，180～220 g；清洁级，均由中国医学科学院实验动物研究所提供。

2 实验方法

2.1 [99Tcm(CO)3(H2O)3]+的制备

向Isolink药盒中加入1 mL 新鲜的Na99TcmO4洗脱液(37～370 MBq)，于95 ℃反应25～30 min，间歇振荡，反应结束后，冷却到室温，用PBS-HCl缓冲液(0.64 mol/L，pH为2.5)调节pH为7.5～8.5。

2.2 DPZM-4、DPZM-8的99Tcm标记[10]

右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8的化学结构示于图1。本研究对两种甘露糖化右旋糖苷衍生物DPZM-4、DPZM-8进行了99Tcm标记。将1 mL [99Tcm(CO)3(H2O)3]+溶液(37～370 MBq)分别加入到含有400 μg DPZM-4或DPZM-8冻干品的注射剂瓶中，摇匀，于98 ℃反应30 min，即制得标记物99Tcm-(CO)3-DPZM-4或99Tcm-(CO)3-DPZM-8。

2.3 99Tcm-(CO)3-DPZM-4与99Tcm-(CO)3-DPZM-8的放化纯度

采用高效液相色谱(HPLC)和放射性快速薄层层析法(ITLC)分析测定标记物的放化纯度。HPLC分析条件：C18色谱柱(Hypersil ODS2，φ4.6 mm×250 mm)，紫外检测器波长选择254 nm，流速为1 mL/ min。淋洗液组成：流动相A 为 0.1%三氟乙酸的水溶液(TFA/H2O)，流动相B为 0.1%三氟乙酸的甲醇溶液(TFA/MeOH)；淋洗梯度：0～4 min，100% A，0 B；4～6 min，100%～75% A，0～25% B；6～17 min，75%～0 A，25%～100% B；17～25 min，0 A，100% B；25～30 min，0～100% A，100%～0% B；30～35 min，100% A，0% B。

ITLC分析以ITLC-SG层析纸(Gelman Sciences公司产品)为支持体，采用上行色谱法。展开体系1以2-丁酮为展开剂，展开体系2 以V(HCl)∶V(甲醇)=1∶20为展开剂，展开体系3以V(吡啶)∶V(乙酸)∶V(水)=3∶5∶1 为展开剂。

2.4 99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8的稳定性

将标记溶液用生理盐水稀释50 倍，于室温下静置5 h，用HPLC和ITLC分析放化纯度，考察其体外稳定性。将99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8由小鼠脚垫皮下注射，给药后1 h取尿液离心，取上清液进行HPLC分析，考察其体内稳定性。

2.5 标记物在正常鼠体内的生物分布

取健康BALB/c小鼠，随机分组，每组 5 只；Wistar大鼠，随机分组，每组 5 只。标记物溶液用生理盐水稀释至放射性浓度为3～37 GBq/L，pH为6～7.5，由正常鼠的右后足脚垫皮下进行不同剂量的注射。注射后按摩脚掌30 s以利于药物吸收，分别于处死前10 min在给药同侧的脚垫处皮下注入专利蓝溶液，再按摩脚掌30 s。分别于给药后1、4 h处死，取前哨淋巴结SLN(即腘窝淋巴结)、次级淋巴结2LN(即腰淋巴结)、注射点(即右后足)、肝、脾、血等，对肝、脾、血称重，测量各器官或组织的放射性计数，计算放射性摄取率(SLN、2LN、注射点单位为%ID，肝、脾、血的单位为%ID·g-1)，并计算SLN提取率(popliteal extraction rate，PE%)，公式如下：

PE%=[(SLN摄取率-2LN摄取率)/SLN摄取率]×100%

2.6 正常大鼠体内的淋巴结显像

取Wistar大鼠，每组3 只，分为 4 组，于每只右后足脚垫皮下注射不同剂量的标记物，分别在给药后不同时间点进行显像，显像前10 min腹腔注射0.8 mL 10%水合氯醛溶液对大鼠进行麻醉。显像数据在计算机系统128×128 矩阵中进行记录与分析，放大倍数1，采集放射性计数50 K/只。

3 结果与讨论

3.1 99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8的制备及稳定性

对于ITLC分析，在展开体系1中，99TcmO4-在前沿，其余组分在原点；在展开体系2 中，99Tcm-(CO)3-DPZM类标记物在原点，其余组分在前沿；而在展开体系3中，99TcmO4-、 [99Tcm(H2O)3(CO)3]+、99Tcm-(CO)3-DPZM类标记物均在前沿。

99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8及标记物稀释50 倍后的HPLC 谱图示于图2(a、b、d、e)。由图2可知，99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8的放化纯度>90%。

a——99Tcm-(CO)3-DPZM-4；b——99Tcm-(CO)3-DPZM-4 (稀释50 倍，静置)；c——99Tcm-(CO)3-DPZM-4小鼠代谢的尿样品；d——99Tcm-(CO)3-DPZM-8；e——99Tcm-(CO)3-DPZM-8 (稀释50 倍，静置)；f——99Tcm-(CO)3-DPZM-8小鼠代谢的尿样品.图2 各种样品的放射性HPLC分析图a——99Tcm-(CO)3-DPZM-4；b——99Tcm-(CO)3-DPZM-4 (50 times dilution，on standing)；c——the urine sample from 99Tcm-(CO)3-DPZM-4 metabolism in mice；d——99Tcm-(CO)3-DPZM-8；e——99Tcm-(CO)3-DPZM-8 (50 times dilution，on standing)；f—— the urine sample from 99Tcm-(CO)3-DPZM-8 metabolism in mice Fig.2 Radio-HPLC profiles of the samples

由图2b、e可见，将99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8溶液用生理盐水稀释50 倍，于室温下静置5 h，标记物缓慢分解(放化纯度下降约10%)，有杂质和聚合物(ITLC分析)生成。

给药后1 h，尿液的HPLC主峰保留时间未变(图2c、f)，表明标记物在小鼠体内未发生分解，具有良好的体内稳定性。

3.2 标记物在正常鼠体内的生物分布

将99Tcm-(CO)3-DPZM-4经右后足脚垫皮下以注射剂量2 μg/25 μL(注射化学量/注射体积)注入正常BALB/c小白鼠体内，研究99Tcm-(CO)3-DPZM-4在正常小鼠体内的生物分布，并与99Tcm-(CO)3-DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)(注射剂量2 μg/25 μL)在正常小鼠体内的生物分布结果[11]进行对比(见表1)。

将99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8经右后足脚垫皮下分别以注射剂量0.006 μg / 5 μL注入BALB/c小白鼠体内，得到相同注射剂量下，两种标记物的SLN摄取及体内分布影响的实验对比结果(见表2)。

将99Tcm-(CO)3-DPZM-4和99Tcm-(CO)3-DPZM-8分别以不同注射剂量0.06 μg / 50 μL、0.05 μg / 10 μL注入Wistar大鼠体内，分别得到两种标记物在不同注射剂量时的SLN摄取及体内分布的影响(见表3)。

根据淋巴结分布结果计算前哨淋巴结提取率PE%，PE%体现了药物在前哨淋巴结滞留的比率，该值越大，说明药物向下一级淋巴结迁移的可能性越小。

表1 99Tcm-(CO)3-DPZM-4与99Tcm-(CO)3-DCM在BALB/c小鼠体内的生物分布结果对比

注：SLN、2LN、注射点摄取率的单位为%ID；肝、脾、血摄取率的单位为%ID·g-1

99Tcm-(CO)3-DPZM-4与连接有半胱氨酸基团的甘露糖基化的右旋糖苷类衍生物99Tcm-(CO)3-DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)的生物分布数据[11]比较可以看出，99Tcm-(CO)3-DPZM-4的SLN摄取和PE%均比99Tcm-(CO)3-DCM高。主要由于两种配合物结构上的差异，DCM类化合物含有半胱氨酸基团支链提供了锝的配位点。

DPZM类标记物显示了较理想的生物分布特征，而99Tcm-(CO)3-DPZM-8又略优于99Tcm-(CO)3-DPZM-4(见表2、表3)。DPZM-4与DPZM-8的化合物结构中每摩尔右旋糖苷螯合的吡唑基-二胺单元的数量不同，DPZM-4含有4个吡唑二胺螯合单元，DPZM-8含有8个吡唑二胺螯合单元，螯合的甘露糖基等基团的数量也略有不同。有研究[9]表明，99Tcm标记的DPZM类化合物的稳定性随每摩尔右旋糖苷所螯合的吡唑基-二胺单元的数量的增加而增加，因此，99Tcm-(CO)3-DPZM-8的稳定性要优于99Tcm-(CO)3-DPZM-4。

表2 99Tcm-(CO)3-DPZM-4与99Tcm-(CO)3-DPZM-8在BALB/c小鼠体内的生物分布结果对比

注：SLN、2LN、注射点摄取率的单位为%ID；肝、脾、血摄取率的单位为%ID·g-1

表3 不同注射剂量对99Tcm-(CO)3-DPZM-4与99Tcm-(CO)3-DPZM-8生物分布的影响

注：SLN、2LN、注射点摄取率的单位为%ID；肝、脾、血摄取率的单位为%ID·g-1

99Tcm-(CO)3-DPZM-4、99Tcm-(CO)3-DPZM-8在Wistar大鼠体内的实验结果(表3)显示，注射剂量会影响此类衍生物的体内行为，当注射剂量 (包括注射化学量和注射体积) 减少时，SLN的摄取率显著提高，SLN提取率也相应提高。注射体积由50 μL减少到10 μL而注射化学量接近时(0.06 μg和0.05 μg)，SLN的摄取增加一倍，SLN的提取率也显著提高，存在显著差异(P<0.01)，但也并不是注射剂量越低越好，注射剂量0.006 μg / 5 μL时的SLN摄取比0.06 μg / 50 μL和0.05 μg / 10 μL均低，差异显著(P<0.005)。

在某些注射剂量及时相，DPZM化合物SLN 的摄取率并不算太高，但值得注意的是，SLN提取率基本都在70%以上，注射剂量为0.06 μg / 50 μL 时，注射后1 h到4 h，2LN摄取率呈下降趋势，SLN的提取率随之增加。

以上结果表明，DPZM类标记物生物分布较理想，具有较高的SLN摄取率，在肝、脾、血等重要组织或器官中摄取较低，且血清除较快。

3.3 Wistar大鼠的淋巴结SPECT显像

99Tcm-(CO)3-DPZM-4分别以剂量a：0.5 μg / 50 μL，2.4×106Bq和剂量b：1.3 μg / 50 μL，6.3×106Bq注射入Wistar大鼠的体内，进行SPECT显像研究，显像结果示于图3。99Tcm-(CO)3-DPZM-8的注射剂量与99Tcm-(CO)3-DPZM-4相同，SPECT显像结果示于图4。

由图3、图4可以看出，显像结果与生物分布结果基本一致，99Tcm-(CO)3-DPZM类化合物具有较高的SLN摄取，给药后5 min，SLN即已显影，在随后的各个不同时相，SLN显像均非常清晰；虽然在注射点仍有较强滞留，但并不影响对SLN的观察；在肝脾等重要脏器中浓集少，全身放射性本底较低。减少注射剂量可以提高SLN的摄取，有利于得到清晰的显像效果。

a—0.5 g / 50 L，2.4×106 Bq；b—1.3 g / 50 L，6.3×106 Bq图3 99Tcm-(CO)3-DPZM-4在Wistar大鼠体内显像结果a—0.5 g / 50 L，2.4×106 Bq；b—1.3 g / 50 L，6.3×106 BqFig.3 SPECT images of 99Tcm-(CO)3-DPZM-4 in Wistar rats

c—0.5 μg / 50 μl，2.4×106 Bq；d—1.3 μg / 50 μl，6.3×106 Bq图4 99Tcm-(CO)3-DPZM-8在Wistar大鼠体内显像结果c—0.5 μg / 50 μl，2.4×106 Bq；d—1.3 μg / 50 μl，6.3×106 BqFig.4 SPECT images of 99Tcm-(CO)3-DPZM-8 in Wistar rats

4 结论

用[99Tcm(CO)3(H2O)3]+标记DPZM类甘露糖基化的右旋糖苷衍生物DPZM-4与DPZM-8，放化纯度均>90%。实验结果表明，99Tcm标记的DPZM类右旋糖苷衍生物在正常鼠体内可获得较高的SLN摄取率和SLN提取率，在肝脾等主要器官的摄取低，血清除较快；另外，其生物分布对注射剂量较为敏感，当注射剂量(包括注射化学量和注射体积)减少时，SLN的摄取率和SLN提取率都相应提高。显像实验结果也表明适当减少99Tcm标记的DPZM右旋糖苷衍生物的注射剂量可以提高SLN的显像效果。综上所述，99Tcm标记的DPZM右旋糖苷衍生物具有优良的前哨淋巴结摄取及体内分布性质，具有应用于前哨淋巴结显像的潜在价值，值得进一步研究。

参考文献：

[1] Mariani G, Moresco L, Viale G, et al. Radioguided sentinel lymph node biopsy in breast cancer suegery[J]. J Nucl Med, 2001, 42: 1 198-1 215.

[2] Easson AM, Rotstein LE, McCready DR. Lymph node assessment in melanoma[J]. J Surg Oncol, 2009, 99: 176-185.

[3] 李艳，李囡，翟士桢，等．特异性前哨淋巴结显像剂99Tcm-rituximab药盒的制备及生物评价[J]．同位素，2011，24(增刊):85-89．

Li Yan, Li Nan, ZhaiI Shizhen, et al. Preparation and Evaluation of a Freeze-dried Kit of99Tcm-rituximab for Sentinel Lymph Node Imaging[J]. Journal of Isotopes, 2011, 24(S1):85-89(in Chinese).

[4] 李洪玉，梁积新，罗洪义，等．99Tcm-硫化铼胶体用于前哨淋巴结检测的生物实验――注射剂量与明胶浓度的影响[J]．同位素，2011，24(2)：72-76．

Li Hongyu, Liang Jixin, Luo Hongyi, et al. Biodistribution of99TcmLabelled Colloidal Rhenium Sulphide for Sentinel Node Detection: the Effects of Dosage and Concentration of Gelatin[J]. Journal of Isotopes, 2011, 24(2):72-76(in Chinese).

[5] Kyoko T, Tomoya U, Emi K, et al.99Tcm-labeled mannosyl-neoglycoalbumin for sentinel lymph node identification[J]. Nucl Med Biol, 2004, 31(7): 893-900.

[6] Hoh CK, Wallace AM, Vera DR. Preclinical studies of [99Tcm]DTPA-mannosyl-dextran[J]. Nucl Med Biol, 2003, 30(5):457-464.

[7] Antonia Woehnl, Carl K Hoh, Jeanette Méndez, et al. Molecular Imaging of the Sentinel Lymph Node via Lymphoseek[J]. Current Clinical Oncology, 2009, 4:123-133.

[8] Wallace AM, Han LK, Povoski SP,et al. Comparative evaluation of [99Tcm]tilmanocept for sentinel lymph node mapping in breast cancer patients: results of two phase 3 trials[J]. Ann Surg Oncol, 2013, 20(8):2 590-2 599.

[9] Alves S, Paulo A, Correia J,et al. Pyrazolyl derivatives as bifunctionalchelators for labeling tumor- seeking peptides with the fac-[M(CO)3]+ Moiety(M ) =99Tcm, Re): synthesis, characterization, and biological behavior[J]. Bioconjugate Chem, 2005, 16: 438-449.

[10] PirmettisI, Arano Y, Tsotakos T, et al. New (99m)Tc(CO)(3) Mannosylated Dextran Bearing S-Derivatized Cysteine Chelator for Sentinel Lymph Node Detection[J]. Mol Pharm, 2012, 9(6):1 681-1 692.

[11] 李洪玉，梁积新，杨春慧，等．99Tcm标记右旋糖苷衍生物DCM-1的淋巴结摄取和显像[J]．同位素，2013，26(1)：16-22．

Li Hongyu, Liang Jixin, Yang Chunhui, et al. Lymph Nodes Distribution and Imaging Study of99TcmLabeled Dextran Conjugate DCM-1[J]. Journal of Isotopes, 2013, 26(1):16-22(in Chinese).