基质金属蛋白酶9在肾细胞癌中的表达与患者临床预后的相关性研究*

戚汝山 宋明山

(1.青岛大学医学院，山东 青岛 266021；2.泰安市第一人民医院，山东 泰安 271000；3.泰山医学院附属泰山医院；山东 泰安 271000)

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是起源于肾实质小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌，简称为肾癌，占成人恶性肿瘤的2%～3%[1]。在所有泌尿系肿瘤中占第二位。近三分之一的肾癌患者在确诊时已发生远处转移而无法接受手术根治。虽然手术切除可治愈大部分的早期患者, 但手术后的复发率仍高达20%～40%[2], 肾癌容易发生转移的部位是淋巴结、肺、骨、脑等器官。转移性肾癌的预后相当差, 中位生存期6～12个月, 5年生存率小于10%。因此转移性肾癌的治疗仍是临床上面临的一项重大挑战。基质金属蛋白酶是高度保守的依赖于锌离子的内切蛋白水解酶家族, 可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。MMP-9属Ⅳ型胶原酶，通过降解细胞外基质及基底膜的主要成分，破坏局部组织结构和基底膜屏障，促进肿瘤新生血管形成等，在肺癌、乳腺癌、结肠癌等多种恶性肿瘤中都有MMPs活性的显著增加。本实验采用免疫组织化学染色方法检测了含有肾癌组织及正常肾组织的病理切片中MMP-9蛋白的表达,分析了MMP-9表达水平与患者年龄、病理分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移、随访记录等临床参数间的关系，探讨了MMP-9与肾癌患者临床预后的相关性。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取泰安市第一人民医院泌尿外科2002年1月至2014年1月间临床肾癌根治性切除术肾癌组织150例，癌旁组织30例，正常肾组织20例，并选取典型癌组织区域，癌旁区域(>2 cm)及正常肾组织制成蜡块。患者年龄26～79岁，中位年龄51.2岁。男性 例，女性 例。患者的分期根据UICC 2009 TNM分期标准，分级根据Fuhrman分级系统。TNMⅠ期：40例，Ⅱ期：64例，Ⅲ：38例，Ⅳ例：18例。Fuhrman分级，1级：35例，2级：74例，3～4级：41例。入选的患者均符合以下标准:具有完整的病例和随访信息,术前均未行手术治疗及放、化疗及内分泌治疗,入选的150例临床肾癌患者均行肾癌根治性切除术。

1.2方法

1.2.1MMP-9测定 免疫组织化学染色(链霉素-过氧化物酶法，SP法)，试剂盒购自北京中山生物科技公司，按说明书进行操作。

1.2.2结果判定 组织芯片免疫组化染色的结果由我院两名病理科的医师在显微镜下独立完成,规定呈现棕黄色染色的细胞为阳性细胞。随机计数5个不同高倍视野(×200倍)，每个视野计数不少于50个细胞,计算出MMP-9阳性的平均细胞数。肾癌组织每个视野的MMP-9染色强度规定如下：10%～50%的肿瘤细胞染色为弱阳性,>50%的肿瘤细胞染色视为强阳性。采用PBS缓冲液代替第一抗体的空白对照作为阴性对照。

1.2.3统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件分析,双边检验P<0.05被认为差异有统计学意义。分级、分期与MMP-9之间的表达水平，各组间样本率的差异的比较采用χ2(chi-square,卡方)检验。Kaplan-Meier方法计算MMP-9表达与患者无复发生存率的生存曲线，用log-rank计算两者生存曲线的区别有无意义。

2 结 果

2.1MMP-9蛋白在肾癌组织中的表达及与临床病理指标之间的关系

免疫组化染色的方法检测了含有肾癌组织及正常肾组织的病理切片中MMP-9蛋白的表达,结果显示肾癌细胞染色主要位于细胞质,并且伴有少量胞核染色，肾癌组染色呈强阳性，而癌旁神组织及正常肾组织染色呈弱阳性(图1)，而且经比较后其差异有统计学意义(P<0.05)。我们随后分析了 MMP-9表达水平与患者年龄、病理分期、分级、肿瘤大小、淋巴结转移等临床病理参数间都有密切关系性。结果表明肾癌患者中MMP-9表达与肿瘤的病理分期、分级、淋巴结转移有关(P=0.009；P=0.017；P=0.004)，但是MMP-9跟年龄和肿瘤大小无明显关系(P=0.412；P=0.083)。

2.2MMP-9表达及临床病理指标与患者预后的关系

通过随访150例患者，从5个月到80个月(中位时间：35.2)，对这些患者进行了统计分析并绘制了生存曲线。通过Kaplan-Meier方法计算了MMP-9及临床病理指标与患者预后的关系。从结果可知，MMP-9表达、肿瘤分级、分期、淋巴结转移与患者的无复发生存率有相关性(P<0.001；P<0.001；P=0.012；P<0.001)，而年龄和肿瘤大小与无复发生存率无明显关系(P=0.596；P=0.063)。我们还通过绘制生存曲线来阐述MMP-9的表达与患者生存率之间的关系(图2)。结果显示，有MMP-9高表达的患者的生存率明显低于MMP-9低表达的患者(P<0.001)。

图1 MMP-9的免疫组化结果

图2.Kaplan-Meier生存曲线

MMP-9高表达与低表达的肾癌患者的无复发生存率的生存曲线，MMP-9高表达的患者的生存率明显低于MMP-9低表达的患者，并且两者的差异有意义(P<0.001)。

3 讨 论

肾细胞癌发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50～70岁[3]，肾癌的病因未明。其发病与遗传、吸烟、肥胖、高血压及抗高血压治疗等有关，遗传性肾癌或家族性肾癌占肾癌总数的2%～4%[4]。影响肾癌预后的最主要因素是病理分期，此外，组织学分级、患者的行为状态评分、症状、肿瘤中是否有组织坏死、一些生化指标的异常和变化等因素也与肾癌的预后有关。基质金属蛋白酶在恶性肿瘤发生和进展中的作用：①降解细胞外基质；②促进新生血管形成；③调节细胞黏附；④激活具有潜在活性的蛋白质。基质金属蛋白酶在癌症病理生理过程中的作用于肿瘤的发病、转移、血管生成等3个阶段,导致癌细胞增长及扩散[5]。基质金属蛋白酶与多种不同组织来源肿瘤的发生、发展、侵袭转移及预后有关, 其中IV型胶原酶(明胶酶A /MMP- 2, 明胶酶B /MMP - 9) 因参与细胞外基质及基底膜的主要成分IV 型胶原的降解而与肿瘤的关系更为密切。肾细胞癌组织MMP-9、TIMP-1的量和血浆中MMP-9浓度均明显高于正常人[6,9]。 史子敏等报道应用半定量RT-PCR技术检测肾癌组织及正常肾组织MMP-9mRNA水平的表达情况，表明MMP-9在肾癌的发生、发展及侵袭转移中起非常重要的作用[7]。王医术等报道应用免疫组化方法检测32例肾细胞癌组织中MMP-9、MMP-11、第八因子相关抗原、a-平滑肌动蛋白和增殖细胞核抗原的表达，表明，MMP-9、MMP-11在肾细胞癌增殖活性和血管生成方面均有重要作用[8]。

我们的研究发现, 肾癌患者的组织样本中MMP-9蛋白表达显著高于正常肾组织(P=0.031)。而肿瘤的分期、分级和淋巴结转移与MMP- 9水平存在显著相关(表1)，MMP-9表达水平也与肾癌患者的无复发生存率有明显相关，MMP-9强阳性表达的患者生存率明显低于MMP-9弱阳性表达者(P=0.037)。综上所述，MMP-9表达与肾癌发生、发展和转移过程中发挥作用，并且与恶性程度有关，我们初步推断MMP-9可作为反映肾癌癌生物学行为的指标, 临床上结合分析MMP-9在肾癌组织中的表达, 有助于判断肾癌的病理学分级, 并有助于进一步评估预后及指导临床治疗。虽然目前研究的癌基因很多,但应用于临床中的很少,MMP-9是其中的一个。因此对患者手术前后的MMP-9水平进行检测, 能够对肾癌患者的发展和预后进行早期干预, 提高生存率。对MMP-9结构和功能, 恶性肿瘤组织、细胞外基质、甚至血浆中的基因表达及与抑制剂(TIMPs)的关系等方面进行更深入的研究,有助于对恶性肿瘤的侵袭和转移性病变机理的认识, 最终为恶性肿瘤的诊断、治疗、预后的评价提供有益帮助。

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