熊果酸对球囊损伤大鼠颈总动脉后内膜增生及PCNA、NF-kB表达的影响*

朱保成 夏 勇

(1.徐州医学院心血管研究所，江苏 徐州 221002；2.徐州医学院附属医院心内科， 江苏 徐州 221002)

随着医疗科技的不断发展，经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)已经是治疗冠心病的重要手段[1]。但其术后30%～50%的再狭窄率，严重限制了PTCA在临床上的应用。药物涂层支架的出现是冠心病介入治疗的一个重大进展，可通过抑制血管的弹性回缩，预防晚期血管重塑，但经皮冠状动脉介入治疗的再狭窄率仍有5%～9%[2]。雷帕霉素及紫杉醇在体外实验中可以显著抑制血管平滑肌细胞的增殖[3]。熊果酸同样为抗肿瘤药物已经被证实具有抑制血管平滑肌细胞迁移增殖[4]，抗炎抗氧化[5]，抗动脉粥样硬化等多重功效。因而，我们制作球囊损伤大鼠颈总动脉模型，研究熊果酸对血管平滑肌细胞迁移增殖的影响及可能机制，为预防PCI术后再狭窄及动脉粥样硬化提供新的思路。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 健康清洁级雄性SD大鼠32只，体重300～350 g，购自徐州医学院实验动物中心。饲养条件：按清洁级大鼠饲养，每笼放3～5只，实验室光照，通风良好并按常规定期消毒。

1.1.2仪器及试剂 1.5 mm×15 mm球囊由美敦力公司提供，熊果酸购于上海晶纯生化科技股份有限公司，NF-kB抗体购于北京中衫金桥生物技术有限公司。PCNA抗体购于北京博奥森生物技术有限公司。SP试剂盒购于北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.2实验方法

1.2.1实验分组及给药方法 将 32只大鼠随机分为假损伤组(对照组)、颈总动脉球囊损伤组(模型组)、颈总动脉球囊损伤+ 熊果酸低剂量(低剂量组)、颈总动脉球囊损伤+ 熊果酸高剂量(高剂量组)，各组8只，每4只为一亚组，分别在术后7 d、21 d取颈总动脉。 对照组只进行手术操作但不插入球囊损伤，术后每天给予等量二甲基亚砜腹腔注射直至取标本；损伤组球囊损伤后给予等量二甲基亚砜腹腔注射直至取标本；熊果酸低剂量组，于造模前2天给予熊果酸每日剂量10 mg/kg 腹腔注射直至取出标本；熊果酸高剂量组，于造模前2天给予熊果酸每日剂量20 mg/kg 腹腔注射直至取出标本。

1.2.2颈总动脉球囊损伤模型的建立 苯巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠。麻醉后大腹面向上固定于手术操作台上，备皮、常规消毒、铺巾，颈部正中切口 ，钝性分离皮下组织，暴露左侧颈总动脉及左颈内、颈外动脉。永久结扎颈外动脉远心段，并临时结扎颈总动脉近心端和颈内动脉。 于颈外动脉剪一V形切口。将1.5 mm×15 mm球囊经颈外动脉切口插入颈总动脉，进至距颈内外动脉分叉处1～2 cm左右用压力泵加压并维持压力2个大气压15秒，缓慢回拉导管至切口处将压力泵回抽使压力降为零。重复上述过程共3次，然后沿剪口近心端结扎颈外动脉，解除颈内、颈总动脉结扎线，逐层缝合皮下组织及皮肤。术后庆大霉素冲洗切口和腹腔注射肝素100 U/kg。

1.2.3标本收集 各组大鼠分别于术后7、21 d处死、取材。 用：苯巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠后，放血处死。取约1～2 cm长的左颈总动脉。PBS漂洗平均分为2段，浸入10%甲醛中于4冰箱固定。

1.2.4组织病理图像分析 24h后将固定于10%甲醛溶液中的血管组织取出，脱水、透明、石蜡包埋。均匀切片(0.5 μm)，经HE染色后在光镜下(×100)观察组织形态学变化及内膜增生情况。采用光学显微镜和Image-pro Plus 6.0图像分析系统对各组HE染色切片进行图像分析，计算血管内膜面积(IA)和内膜与中膜面积比(IA/MA)。

1.2.5免疫组织化学检测核因子(NF-kB)及增殖细胞核抗原(PCNA) 采用免疫组化SP法免疫组化染色，按试剂盒操作说明进行试验。每段血管随机选取3张切片，在高倍光学显微镜(×400)下观测增殖情况，Image-pro Plus 6.0分析图片，统计细胞阳性率。

1.3统计学方法

2 结 果

2.1熊果酸能减少颈动脉球囊损伤后内膜增厚程度，观察术后7d、21d颈总动脉病理切片，见图1。7d熊果酸高、低剂量组内膜面积(IA)和内膜与中膜面积比(IA/MA)较损伤组无明显减少(P>0．05)。21d熊果酸高、低剂量组内膜面积(IA)和内膜与中膜面积比(IA/MA)较损伤组明显减少(P<0．05)。21 d熊果酸高剂量组内膜面积(IA)和内膜与中膜面积比(IA/MA)较熊果酸低剂量组显著减少(P<0．05)。(表1)。

2.27 d、21 d各组大鼠PCNA阳性细胞率

7d熊果酸高、低剂量组增生组织中可见PCNA表达的阳性率较损伤组降低，差异有统计学意义(P<0．05)。21d熊果酸高、低剂量组增生组织中可见PCNA表达的阳性率较损伤组无明显降低，差异无统计学意义(P>0．05)。7d熊果酸高剂量组PCNA表达阳性率较熊果酸低剂量组减低，差异有统计学意义(P<0．05),见图2，表1。

2.37d、21 d各组大鼠NF-kB阳性细胞率

对照组两时间点阳性细胞极少， 熊果酸高、低剂量组两时间点增生组织中可见NF-kB表达的阳性率较损伤组均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。7d、21d熊果酸高剂量组NF-KB表达阳性率较低剂量组均减低，差异有统计学意义(P<0.05),见图3，表1。

1.21天模型组；2.21天低剂量组；3.21天高剂量组；4.21天对照组

5.7天模型组；6.7天低剂量组；7.7天高剂量组；8.7天对照组

表1 7d、21d各组内膜面积(IA)和内膜与中膜面积比(IA/MA)及PCNA、NF-kB 免疫组化细胞阳性率情况

注：*P较21天模型组(<0.05)；#P较21天模型组(<0.05)；**P较7天模型组阳性率(<0.05)；##P较7天模型组(<0.05)；###P较21天模型组(<0.05)

图1 7d、21d各组颈总动脉新生内膜增生情况(×100)

1.21天模型组；2.21天低剂量组；3.21天高剂量组；4.21天对照组;6.7天模型组；6.7天低剂量组；7.7天高剂量组；8.7天对照组

图2 7d、21d各组PCNA表达的免疫组化情况(×400)

图3 7d、21d各组NF-kB表达的免疫组化情况(×400)

3 讨 论

PTCA术后再狭窄的形成与内膜增生、血管平滑肌细胞的迁移和增殖、血管弹性回缩以及炎症有关已得到广泛证实。其中血管平滑肌细胞(VSMC)的迁移和增殖与炎症因子的作用是血管再狭窄的主要机制。本实验主要研究熊果酸对球囊损伤大鼠颈总动脉内膜增生及核因子-kB的影响。

NF-kB是一类具有多向性转录调节作用的蛋白质家族。它在机体免疫、炎症、细胞增殖、黏附等方面发挥重要的作用[6]。NF-kB是Rel蛋白家族的成员以同源或异源二聚体的形式组成的一组转录因子。静息状态下，NF-kB蛋白二聚体与特异性抑制蛋白IKB形成三聚体，以非活化形式存在于细胞质中。当外界因素作用于细胞后，NF-kB得以激活，进入细胞核，继而作用于靶基因，并迅速诱导基因表达，导致炎症、增殖反应的发生。等实验证明，NF-KB参与了AS中血管平滑肌细胞(vSMc)、血管内皮细胞(VEC)增殖和迁移的调节。熊果酸是存在于天然植物中的一种三萜类化合物，具有抗炎、抗肿瘤、抗氧化、等多种生物学效应。Pozo[7]等率先报道了UA对大鼠颈动脉囊球导管血管损伤模型的影响。他们发现uA能抑制损伤血管内膜新生和中膜中血管平滑肌的迁移和增殖。本实验中熊果酸减少了NF-kB的表达，使血管管腔较模型组增生减少。

PCNA是一种酸性核蛋白在DNA复制中起重要作用[8]，其含量在静止期细胞极少。PCNA因此被认为是在正常和疾病状态正在增殖的细胞的一个标志。为评估熊果酸在核水平调控血管平滑肌增殖的影响，我们检测PCNA的表达。在本实验中可观测到增殖的血管平滑肌细胞中有大量PCNA的表达，而熊果酸可明显抑制PCNA的表达。

经皮冠状动脉介入治疗(PCI)过程中，球囊损伤内皮及支架植入引起的炎症反应引起血管平滑肌细胞(VSMCs)向内膜迁移增生，基质分泌导致的支架再狭窄又与动脉粥样硬化的发生机制有相似之处。本实验中熊果酸药物组与损伤组比较，明显减少内膜增生程度，其主要机制可能是NF-kB与MMPs、COX-2的表达有关[9]，待进一步证实。对于熊果酸与动脉粥样硬化的关系尚有争议[10]，需要更多论证。

[1] Kattainen E，Merilainen P，Jokela V，et al.CABG and PTCA patients expectations of informational support in health- related quality of life themes and adequacy of information in 1-year follow-up[J].J European Journal of Cardiovascular Nursing, 2004,3：149-163.

[2] Sino—SIRIUS研究组．国人应用西罗莫司药物洗脱支架预防再狭窄的初步经验[J]．中华心血管病杂志，2003，31：814-817．

[3] Christian M，Izabela R，Andrea J，et al.Effects of Tacrolimus or Sirolimus on Proliferation of Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cells[J].J Cardiovasc Pharmacol, 2006,48：286-292.

[4] 王文隆，邓洁，赵崇强，等．熊果酸对大鼠血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制研究[J]．心肺血管病杂志．2013，32：625-627．

[5] Muhammad S，Syed A，Saima J，et al.Ursolic Acid: A Potent Inhibitor of Superoxides Produced in the Cellular System[J].J InterScience, 2007,21：558-561.

[6] Schottelius A，Baldwin A，et al.A role for transcription factor NF-k B in intestinal inflammation[J].J Springer-Verlag,1999,14：18-28.

[7] Pozo M，Castilla V，Gutierrez C，et al.Uroslic acid inhibits neointima formation in the rat carotid artery injury model[J]．J Atherosclerosis, 2006,184：53-62.

[8] Mayanagi K， Kiyonari S，Nishida H，et al.Architecture of the DNA polymerase B-proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-DNA ternary complex[J].J BIOCHEMISTRY, 2011,108：1845-1849.

[9] Takada Y, Aggarwal BB.Betulinic acid suppresses carcinogen-induced NF-kappa B activation through inhibition of I kappa B alphakinase and p65 phosphorylation: abrogation of cyclooxygenase-2 and matrix metalloprotease-9[J].J Immunol,2003,171:3278-3286.

[10] Tannock L.Ursolic acid effect on atherosclerosis: Apples and apples, or apples and oranges[J].J Atherosclerosis,2011,219：397-398.