从泰山赤灵芝对重复运动后骨骼肌微损伤修复探讨武术运动员的运动疲劳的恢复研究*

李 晨 吕晨曦

(泰山医学院运动医学与康复学院，山东 泰安 271016)

随着武术运动的不断发展，武术竞技水平逐年提高，比赛日趋白热化。为了不断提高武术运动水平，平时的大运动量重复运动训练(力竭运动)就成为提高武术运动员竞技水平、运动成绩的重要手段，随之而来的运动性骨骼肌微损伤(exercise-induced muscle damage，EIMD)在所难免。在各种运动项目的损伤类型中，骨骼肌微损伤所占的比率最高[1]。目前，多数学者认为，重复离心运动导致的骨骼肌超微结构变化不是损伤，而是骨骼肌肌节重塑过程。不同的运动方式、运动项目都可以引起骨骼肌超微结构变化。提示重复运动训练可能对骨骼肌纤维的损伤产生一定的累加作用，本研究旨在能通过电镜获得大强度运动及补充泰山赤灵芝后大鼠骨骼肌超微结构变化图像；利用图像分析以及生物信息学手段进行鉴定、分析，推测其在骨骼肌微损伤过程中可能起到的预防作用以及骨骼肌损伤修复过程中可能存在的促进修复机制。

1 材料与方法

1.1一般资料

动物模型构建及分组：成年雄性SD大鼠52只，随机分为2组：对照组、实验组。重复运动的动物模型构建：大鼠在跑台上进行下坡跑，速度18 m/min，坡度-16度，进行大运动量重复训练(力竭运动)。设立实验组(喂养泰山赤灵芝水煎液)、对照组，进行同样的重复力竭运动，在同一时间点分别对正常对照组、实验组在大运动量重复训练(力竭运动)后取股四头肌，同时对实验组大鼠进行治疗量泰山赤灵芝喂养，考察该药对大运动量重复训练(力竭运动)下大鼠骨骼肌微损伤变异是否有影响。观察对照组、实验组大运动量重复训练(力竭运动)下大鼠骨骼肌超微结构变异进行研究。所有大鼠实验前均未进行过跑台运动。动物饲养室符合国家二级动物饲养标准，自由饮食。

1.2实验方案

1.2.1设立实验组(喂养泰山赤灵芝水煎液)、对照组，进行同样进行大运动量重复训练(力竭运动)，在同一时间点分别对正常对照组、实验组在大运动量重复训练(力竭运动)后用颈椎脱臼法处死，在股四头肌上取大、小两块肌肉，小块肌肉迅速切成米粒大小的组织块，取材后放入浓度为3.5%的戊二醛固定液中固定过夜(备电镜观察)。大块肌肉放入浓度为10%的中性缓冲福尔马林固定液中固定过夜(备光镜观察)。

1.2.2电镜标本及切片制作 电镜标本用0.1M pH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗5次，每隔20 min冲洗一次。用1%的锇酸(四氧化锇)再固定4 h后，再用0.1M、pH值为7.2的磷酸缓冲液冲洗5次，每20 min一次。用梯度乙醇脱水(30%、55%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇)每步时间为30分钟，再用环氧丙烷过渡两次，每次2 h。使用Epon812树脂浸透，包埋，聚合。使用LKB超薄切片机进行超波切片，用醋酸铀—柠檬酸铅双染色。制成的电镜切片使用美国GE公司生产的透射电镜(山东农业大学)进行观察，并拍照。

1.3指标观察 电镜下观察

1.3.1骨骼肌的粗、细两种肌丝、位于肌节的A带、M线、Z线、H带、I带、A带。

1.3.2横小管 是肌膜向肌浆内凹陷形成的小管网，横小管可将肌膜的兴奋迅速传到每个肌节。

1.3.3线粒体(mitochondrion)：粒体为线状、长杆状、卵圆形或圆形小体，外被双层界膜。

1.3.4细胞核 主要看核膜厚度、基质电子密度高低、有无核边集现象。

2 结 果

2.1光镜结果(HE染色)：对照组显示纵切面上骨骼肌细胞呈细长的纤维状、排列整齐无分支，胞质多呈强嗜酸性(为I型纤维)；核小数多, 位于肌膜下，染色较浅。横纹清晰、规则。横断面观察，细胞多呈不规则的圆形，直径大小不同，以强势酸性者为主，弱嗜酸性者较粗(为II型纤维)，核小呈圆形。对照组、实验组大运动量重复训练(力竭运动)下大鼠骨骼肌超微结构可见肌细胞肿胀，节段性着色变浅局灶性损伤扩大，血管扩张出血溢血现象明显，局部炎细胞多见损伤处断片排列紊乱、界线不清的溶解现象严重。但细胞肿胀减轻、损伤灶缩小。实验组(喂养泰山赤灵芝水煎液)细胞肿胀进一步减轻、损伤灶缩小。

图1 (光镜)CK组：纵切面上骨骼肌细胞呈细长的纤维状、排列整齐无分支，胞质多呈强嗜酸性(为I型纤维)；核小数多, 位于肌膜下，染色较浅。横纹清晰、规则。

横断面观察：细胞多呈不规则的圆形，直径大小不同，以强势酸性者为主，弱嗜酸性者较粗(为II型纤维)，核小呈圆形。(左：纵切图；右：横切图)

2.2电镜结果

2.2.1对照组、实验组大运动量重复训练(力竭运动)下线粒体出现水肿，内部的嵴开始融解，出现空泡化现象，其外膜不完整。内质网、肌纤维均出现不同的变化。

2.2.2实验组(喂养泰山赤灵芝水煎液)肌细胞机能开始恢复，线粒体虽然仍有受到损伤的迹象，但已可以看出正在开始逐渐恢复。细胞结构恢复的较好，但线粒体数量较少，同时外膜进一步恢复。

大运动量重复训练(力竭运动)下，线粒体数量较少，外膜不完整；骨骼肌超微结构有显著改善，但是仍表现为肌原纤维排列不规则，肌节不完整，Z线变细，肌丝卷曲等表现。

研究结果显示：大运动量重复训练(力竭运动)及离心运动均可以引起骨骼肌超微结构的损伤。损伤变化主要表现为：运动后即刻骨骼肌细胞膜发生局部模糊、溶解，肌纤维间嵴有缺损，核膜皱缩，肌细胞内线粒体空泡变性改变。随着时间的延长，至大强度运动(重复运动)下损伤程度最重，出现肌纤维排列紊乱、扭曲，肌细胞膜溶解，Z线紊乱呈锯齿状，且部分消失，线粒体空泡变性改变加重。同时对实验组大鼠进行治疗量泰山赤灵芝喂养超微结构图像显示骨骼肌细胞超微结构、功能逐渐恢复，机体损伤程度开始逐渐降低，随着时间的推移肌纤维排列基本正常，细胞膜部分皱缩，核膜间隙局部扩张，未见肌纤维水肿，Z线明暗带、M线均可分清。大运动量重复训练(力竭运动)且长时间、重复离心运动较一次性运动更容易引起骨骼肌超微结构的异常性变化，并延续到运动后数天，是造成运动功能下降、身体疲劳、酸痛、进而影响正常训练和比赛的重要原因。

图2 线粒体高度水肿。 嵴融解、空泡化现象

图3 肌细胞机能开始恢复， 线粒体仍有受损迹象

图4 I带出现过度收缩膜为正常现象，结构开始恢复

图5 细胞结构、线粒体数量进一步恢复

图6 线粒体变化并不大仅数量较少

图7 线粒体外膜核基质模糊

图8 线粒体空泡化严重

图9 肌节I带变长，肌丝卷曲

图10 线粒体数量较少，I带拉长，Z线扭曲，核膜增厚

图11 结构虽有改善，但排列仍不规则，肌节不完整，Z线变细，肌浆膜肿胀

3 讨 论

我们知道，武术运动员骨骼肌的舒张与收缩运动是各种关节运动的基础，其肌纤维受运动神经元轴突末梢的支配。当神经冲动传到末梢时，兴奋经神经——骨骼肌接头传递给肌纤维，引起肌纤维的兴奋与运动。随着武术运动的不断发展，竞技武术水平逐年提高，武术比赛日趋白热化，对武术运动员的体力、体能、综合素质的要求越来越高，骨骼肌超微结构机能训练及调整的作用越来越受到武术教练们的高度重视，使得科学合理的安排大运动量(力竭运动)训练成为提高武术运动成绩的重要手段。武术运动员的骨骼肌超微结构损伤是竞技体育运动中常见的损伤，在各种竞技运动项目的损伤类型中，骨骼肌超微结构损伤所占的比率最高[2]。由于损伤后导致骨骼肌超微结构组织的病理机制改变等，对武术运动员的运动能力、运动寿命构成潜在威胁，所以充分研究骨骼肌超微结构损伤机制，了解其病理变化的特点及规律，探讨其相应的预防、治疗及康复措施等，一直都是运动医学研究领域中的一个重要课题。在现代武术竞技运动中骨骼肌超微结构损伤多见于像武术运动训练这样的周期性重复大运动量(力竭运动)的速度、耐力、力量、灵敏等方面训练中，其中以重复离心运动训练时损伤最为明显。因此，在骨骼肌超微结构运动性损伤的实验中，很多学者都采用下坡跑的离心运动方式复制骨骼肌超微结构损伤的病理模型[8-11]。原因是动物在下坡跑的过程中，骨骼肌超微结构需要抵抗身体重量而进行离心收缩做功，肌纤维组织承受过度载荷而致伤。同时研究证实，大运动量、尤其是离心运动会导致骨骼肌超微结构延迟性损伤。然而，连续性的离心运动训练与骨骼肌超微结构损伤之间的研究却不多见，且研究结果也并不一致[8,9]。

我们在实际的武术运动训练过程中，武术运动员机体在进行大运动量、强度突然增加或运动方法改变时，通常会诱发肌肉延迟性酸痛(DOMS)的现象。1902年，Hough首先进行了，并提出了DOMS损伤学说，并认为酸痛是由于肌纤维内部的破损造成的[2]。事实上，延迟性肌纤维酸痛及其伴随改变常发生在武术运动训练中。武术运动包含有大量离心舒张与收缩成分的肌纤维运动，这是武术运动训练中不可避免的现象。据此，延迟性肌肉酸痛产生机制较多认为与肌纤维损伤时的急性炎症有关。近来，国内学者提出，环境或运动疲劳与骨骼肌超微结构、功能的变化直接相关。这些变化主要包括敏感细胞器线粒体的积极响应，能源物质的积累，骨骼肌纤维结构的改变和自由基、ATP等对细胞凋亡的启动[12,13]。

二十世纪六十年代以来，通过对人和动物肌纤维超微结构及机制的研究，提供了肌纤维损伤的直接证据：运动性骨骼肌微损伤在电镜下主要表现为线粒体肿胀、收缩蛋白和细胞骨架的变化。其中，Z盘是整个肌节结构中最容易受破坏的部位。这种变化表现为Z盘加宽、Z带断裂或完全消失。离心运动所引起的骨骼肌超微结构变化更明显，A带也会出现损伤性变化。应当注意的是，运动性骨骼肌微损伤(Micro-injury of Skeletal Muscle)仅占全部肌纤维的极小部分，在人体实验中，由于取样技术、活检取样的限制，研究时往往遗漏某些肌纤维的超微结构变化，可能会造成不同的研究结果。

目前，关于力竭离心运动的研究逐渐增多，力竭离心运动引起骨骼肌超微结构的损伤主要表现为：运动后即刻：肌细胞膜发生局部模糊、溶解，肌纤维间嵴有缺损，核膜皱缩，肌细胞内线粒体空泡变性改变。随着时间的延长损伤程度加重，出现肌纤维排列紊乱、扭曲，肌细胞膜溶解，Z线紊乱呈锯齿状，且部分消失，线粒体空泡变性改。进行治疗量泰山赤灵芝喂养超微结构图像显示骨骼肌细胞超微结构、功能逐渐恢复，机体损伤程度开始逐渐降低，随着时间的推移肌纤维排列基本正常，细胞膜部分皱缩，核膜间隙局部扩张，未见肌纤维水肿，Z线明暗带、M线均可分清。大强度运动(重复运动)且长时间、重复离心运动较一次性运动更容易引起骨骼肌超微结构的异常性变化，并延续到运动后数天，是造成运动功能下降、身体疲劳、酸痛、进而影响正常训练和比赛的重要原因。

关于重复运动训练，早在本世纪60年就有研究者从动物身上获得了组织学证据，证明反复运动可以引起骨骼肌超微结构的变化。田野、杨锡让等[14]针对运动性骨骼肌超微结构以及机能变化的机制问题进行了一系列的研究证实，力竭性离心运动可引起大鼠比目鱼肌出现形态学改变，这些改变包括肌原纤维排列不规则，Z线呈锯齿状或波形异常，甚至消失。通过定量统计力竭运动后Z线异常百分率得出：骨骼肌超微结构损伤随着运动后时间的不断延长，先出现加重状况。与本组光镜下结果一致。本实验中我们发现离心运动后骨骼肌出现明显的组织形态结构和超微结构的变化，并且，这种变化具有明显的时相性和延迟性，重复运动过程中骨骼肌超微结构有恢复的趋势，如开始阶段以间质血管改变和炎症细胞浸润为特征，随后则可见肌细胞肿胀，电镜下骨骼肌细损伤的组织形态变化表现主要有：肌原纤维排列混乱、肌节、肌丝排列紊乱、Z线模糊、扭曲，呈锯齿状、波纹状变化。肌核肿胀或固缩，线粒体肿胀等。这种变化是骨骼肌对运动负荷刺激的反应，提示这种运动性骨骼肌微损伤未必是一种完全的病理过程，可能是骨骼肌适应运动训练刺激的一个介于生理与病理的中间过程——“先解离而后才重新建构”，可能正是骨骼肌对运动训练刺激的一种适应[15,16]。

目前，公认的理论是运动性骨骼肌微损伤是由于长时间、高强度、重复运动后结果，常表现为延迟性肌肉酸痛，尽管有自主缓解现象，但由于延迟性肌肉酸痛的症状体征对运动训练的影响，以及肌肉酸痛与肌纤维拉伤有某种内在的联系等原因。所以，几十年来国内外学者一直尝试了解运动性微损伤的特性、力求寻找一些解决措施。为探寻最新的、可靠的、有效的方法来干预运动性骨骼肌微损伤的发展提供理论参考依据。目前，解释骨骼肌微损伤现象的假说主要是机械损伤和化学损伤两种假说[17]。机械损伤理论(高张力理论)认为运动性骨骼肌超微结构变化起因于机械因素，主要依据Morgan和Morgan等提出的离心运动时肌节长度不均一性学说(sarcomere length non-uniformities)和肌节爆裂学说(popping sarcomere hypothesis)，其主要论点是：离心运动时由于肌节被动拉长的长度不均一，且肌节长度-张力曲线处于降支状态时肌节结构稳定性最差，导致较弱肌节被过度牵拉[3]。并认为疼痛是由肌纤维结构损伤引起的，其中包括肌纤维损伤和结缔组织损伤。化学假说：运动应激使肌细胞增加的自由基将攻击细胞膜脂质，出现脂质过氧化，产生大量丙二醛(MDA)，引起细胞膜通透性的改变，钙离子进入细胞内，细胞内钙的超载将抑制细胞内呼吸链，从而导致ATP生成减少及有巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞参与的炎症反应等。所以用两种或两种以上的假说综合解释骨骼肌微损伤似乎更为合理。据此，人们设计出了补充人参皂甙Re和Rb1保护中等强度运动训练大鼠骨骼肌超微结构，效果满意[18]。张海平等[1]进行了维生素E对离心运动大鼠骨骼肌超微结构影响的研究，结果显示：维生素E对运动性骨骼肌损伤的预防作用主要是通过抗氧化作用完成的。运动前和运动中补充维生素E，可以在活性氧与生物膜发生反应之前，捕捉自由基以阻滞不饱和脂肪酸的过氧化反应，减少过氧物质的生成，使细胞膜结构免受氧化破坏，膜的完整性得以保护，必然会保护细胞内膜结构各ATP酶的活性，调节和修正由于运动而出现的钙稳态失调，降低胞浆钙离子的含量，减少由于细胞内钙超载引起的骨骼肌损伤，从而达到对骨骼肌微损伤的预防作用。

总之，武术运动员在平时的大运动量训练中产生运动性疲劳现象是不可避免的，也是造成和限制运动训练效果的重要因素之一。适度的重复运动训练(骨骼肌疲劳然后施以合理的恢复手段)可以促进人体机能水平的提高，而过度的运动性疲劳和不及时消除的疲劳堆积，无助于提高武术运动员机能及运动技能水平，最终对骨骼肌超微结构的病理性损伤形成损害。武术运动员在训练期给与适当的治疗量泰山赤灵芝药物干预有助于运动性骨骼肌微损伤的修复。

4 值得进一步研究的题目

①重复离心运动导致的骨骼肌超微结构变化是病理性损伤，还是肌节的主动适应过程。

②骨骼肌超微结构变化与基质、肌膜结构的关系。

③肌节恢复、重塑过程是否需要炎症因子参与(有学者报道：运动后血液中与炎症反应有关的蛋白、如急相蛋白和炎症过程指示物含量增加)等是今后研究的方向。

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