精浆叶酸、维生素B12对精子DNA完整性影响的研究*

亓贯和 王 静 张 圆

(1.泰安市第一人民医院检验科，山东 泰安 271000； 2. 泰安市中医医院检验科，山东 泰安 271000)

男性不育是一种多病因引起的疾病。近年来，男性不育发病率呈上升趋势，已占不育夫妇的20%以上[1]，精子DNA的完整性与男性不育有密切的相关性[2]。正常生殖功能的生成，包括精卵顺利结合、细胞膜融合、精卵染色体的组合以及以后的胚胎发育均在一定程度上依赖精子DNA的完整性，无论是体内受精，还是体外人工受精，精子DNA异常都会导致生殖异常[3]，精浆叶酸和维生素B12是精子生成和维持精子功能的必要物质，是精子DNA合成与维护精子生长环境的条件之一。本研究旨在通过检测精浆中叶酸与维生素B12浓度水平与相应标本中精子DNA完整性的相关性，探讨其在评价男性生育力水平的应用价值。

1 材料与方法

1.1研究对象 2011年12月至2012年6月来我院就诊的203名男性不育患者，年龄28～42岁，平均32.6岁，结婚2年以上，未采取避孕措施，性生活正常，无吸烟、酗酒等不良生活史，排除女方不孕以及先天性生殖功能障碍等因素。

1.2仪器试剂 国产WLJY—9000型伟力彩色精子质量检测系统及配套设备，Elecsys2010型全自动电化学发光免疫分析仪(瑞士罗氏公司)及配套试剂，1616-1高速离心机(上海医疗器械集团有限公司)。吖啶橙染色(acridine orange test AOT)液配制：吖啶橙0.8 g柠檬酸7.4 g，Na2HPO4·12H2O 2.36 g加水至462 ml备用[4]。荧光显微镜(噢林巴斯公司产品)。

1.3方法

1.3.1标本采集 受试者在禁欲3～7天后，洗净外生殖器，手淫法取全部精液于一次性无菌容器中，将精液置于37 ℃水浴，待精液液化后，取出于1 h内检测。

1.3.2标本分组 精子记数板37 ℃预温2 min，微量吸管吸取5 μl 精液置于记数板精液池中。37 ℃保温2 min后进行检测。在20×物镜下分析10～15个视野，每视野采集20帧图像，得出分析结果。结果包括一次射精体积、精液浓度、精子数量、良好精子能动性和精子正常形态。通过所得数据，将精子浓度>20×106/ml并且生育能力较正常的患者作为对照组，将精子浓度<20×106/ml生育能力较低下的患者作为实验组[5]。符合此类条件的对照组有72例，实验组55例，中间患者为76例。

1.3.3叶酸与维生素B12检测 取精液放入离心机中4000 r/min，离心10 min，分离精浆，用全自动化学发光免疫分析仪检测[6]。

1.3.4DNA断裂指数 (DFI)测定 DFI值为异常染色质结构精子的比例[7]，吖啶橙染色法(acridine orange test AOT)检测DFI。精液标本37 ℃水浴，液化后, 用PBS(0.01 mol∕L,pH7.4)离心洗涤3次,用PBS调整精子浓度为50×106/ml取15 μl精子悬液涂片。空气干燥之后, 用固定液固定精液涂片至少3 h 或整夜。冲洗和空气干燥后, 用新鲜的AO染液染色5 min ,然后, 轻柔冲洗载玻片并干燥。光显微400倍放大率下至少观察200个精子, 激发光为450～490 nm。具有正常双链DNA的精子荧光呈绿色, 变性的和单链DNA呈红色、橙色、黄色。DFI表示呈红色、橙色、黄色精子所占精子总数的百分比。

1.4统计学分析 应用SPSS 11.0统计软件进行t检验，P<0.05为有显著性差异。

2 结 果

2.1DFI与精液参数 两组DFI与精液参数检测结果比较见表1。

表1 两组DFI与精液参数检测结果比较

表2 两组精浆叶酸、维生素B12检测结果比较

3 讨 论

男性生殖能力低下由多种因素导致，多数低生育问题由遗传因素决定，而迄今医学科技水平尚未能很好的解决遗传问题，然而我们可以在调节生育方面提前做到良好的改善和预防，将男性不育的问题降到最低。精浆是输送精子的必须介质，并为精子提供能量和营养物质。最近几年，已有部分研究表明精浆中所含的维生素B包括叶酸、维生素B12对男性不育起了一定作用[1]，但是尚未明确仍需证实，维生素B的浓度不足可导致受损的甲基化循环浓度的提高，与此同时，磷脂质的甲基化作用，蛋白质、DNA和RNA的合成和修复过程都会影响精子的形成，一旦发生紊乱必会对男性不育有严重影响。

通过研究我们得出可生育男性精浆中低浓度的叶酸、维生素B12与多数DNA损伤之间有密切的关系。首先我们根据精液参数所得到的精子浓度将研究对象划分为试验组与对照组，精子浓度的选取是根据大量临床试验获得的正常生育能力值，使结果更具准确性。

叶酸缺乏会增加DNA的脆弱性[8]，由于尿嘧啶代替了胸腺嘧啶，胸腺嘧啶错误插入进而导致尿嘧啶与胸腺嘧啶双重交替使得染色体结构不稳定[9]；而叶酸缺乏亦会导致甲基基团供应减少从而导致DNA损伤。维生素B12与叶酸同样作为合成DNA的重要辅酶，在组织的合成与修复，以及精子的形成都起了重要的作用，但是迄今尚未有明确的实验验证单独的维生素B12对精子中DNA的影响显著，需要我们进一步验证。

精子中DNA包括了精子核DNA以及中部线粒体的DNA[10]。精子核DNA携带遗传信息，mtDNA则为精子获能后提供能量，两者都是具有重要作用的细胞器，我们通过DNA断裂指数评估精子核染色体中结构的分析指数，为了表明此研究的严谨性，我们加入了对精液常规分析与DFI之间关系的确证试验。

从实验中，我们可以看出对照组(n=72)和实验组(n=55)精液常规分析的一次射精体积在统计学上并没有显著差异(P>0.05)，而其他指标如精液浓度、精子数量以及精子能动性则有显著差异(P<0.01)，最终我们证实DFI与精液浓度、精子数量以及精子能动性呈负相关关系，与一次射精体积呈正相关关系，精子常规中精液浓度、精子数量以及精子能动性在男性不育中起了非常重要的决定作用，从而说明DFI与不育呈负相关关系，而根据本次实验，在DFI>30%左右多数参与者为不育患者，而DFI<30%左右参与者具有一定的生育能力，极少数不具有此相关关系。本研究中，我们根据表1的试验结果，将对照组(n=72)与实验组(n=55)分别加入了DFI对照指数，分别对应对照组(DFI<30%)，实验组(DFI>30%)，进而分析检测叶酸与维生素B12的浓度与DFI的对应关系。测得叶酸的结果在实验组与对照组统计学上差异显著，具有统计学意义，在排除其他过程代谢产物影响的前提下，根据数据可判定精浆叶酸含量与DFI呈负相关关系，据此可判定精浆叶酸的浓度对精子DNA完整性起了一定的作用；维生素B12在实验组(n=55)和对照组(n=72)具有显著差异，具有统计学意义，从而证实了之前做过的维生素B12对男性不育有很重要的影响[11]。但是，由于实验设计上仍有一定的缺陷，无法完全准确排除其他诸如影响实验的部分因素，使得实验结果并不如预期的理想，仍需要全面针对精浆中DNA分子诊断进一步研究。

综上所述，对于男性生殖能力的评价指标不能只局限于常规精液分析，精浆中低浓度的叶酸(平均值≤21.4 nmol/L)与精子DNA损伤水平增加有关联，并验证了低浓度叶酸是DNA稳定性的决定因素，而精浆中的维生素B12与精子数量有密切联系，精子数量增加使维生素B12的浓度相应增加，而DFI与精子数量有显著相关性，从而建立了维生素B12与DFI之间关联关系，进而证明维生素B对DNA完整性产生重要影响，并确证了维生素B在男性精子形成过程中地位的重要性，但仍需我们对维生素B对DNA完整性影响的内在机理作进一步研究。

[1] Elshal MF,El-Sayed HI,Elsaied MA,et al.Sperm head defects and disturbances in spermatozoal chromatin and DNA integrities in idiopathic infertile subjects:Association with cigarette smoking[J].Clin Biochem， 2009，42(7-8):589-594.

[2] Schwartz M, Vissing J. Paternal inheritance of mitochondrial DNA[J]. N Engl J Med,2002,347(8):576-580.

[3] Bank S ,King SA, Irvine DS,et al.Impact of a mild scrotal heat stress on DNA integrity in murine spermatozoa[J].Reproduction ,2005,129(4):505-514.

[4] Erenpreiss J,Hlevicka S,Zalkalns J,et al.Effect of leukocytospermia on sperm DNA integrity：a negative effect in abnormal semen samples[J].J Androl， 2002,23(5):717-723.

[5] Smith R,Kaune H,Parodi D， et al.Increased sperm DNA damage in patients with varicocele:relationship with seminal oxidative stress[J].Hum Reprod,2006,21(4)：778-780.

[6] Larson-Cook KI, Brannian JD, Hansen KA，et al. Relationship between the outcomes of assisted reproductive techniques and sperm DNA franentation as measured by the sperm chromatin structure assay[J].Fertil Steril，2003,80(4):896-913.

[7] Wyobek AJ,Eskenazi B,Young S,et al.Advancing age has differential effects on DNA damage,chromatin integrity,gene mutations,and aneuploidies in sperm[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(25)：650-655.

[8] Aitken RJ,Harkiss D,Knox W,et al.A novel signal transduction cascade in capacitating human spermatozoa characterized by a ridox-regulated,cAMP-mediated induction of tyrosine phosphorylation[J]. I Cell Sci,1998, 111(pt 5 ):645-655.

[9] Seli E,Gardner DK,Schoolcraft WB,et al.Extent of nuclear DNA damage in ejaculated spermatozoa impacts on blastocyst development after in virot fertilization[J]. Fertil Sreril，2004,82(2):378-383.

[10] Aoki VM,Moskovtsev SI,Willis J,et al.DNA integrity is compromised in protamine-deficient human sperm[J].J Androl，2005,26(6):741-748.

[11] Kapranos N,Petrakou E,Anastasiadou C,et al.Detetion of herpes sinrplex virus ,cytomegalocirus and Epsteirr Barr virus in the scmen of men attending infertility clinic[J].Fertil Steril,2003,79:1566-1570.