谷氨酸损伤体外培养大鼠螺旋神经元中凋亡诱导因子的表达与分布*

丁忠家 唐晓旭 陈鑫 宋勇莉 米文娟 王剑 陈福权 邱建华

现阶段细胞凋亡机制，主要以线粒体为中心，包括半胱氨酸天冬氨酸(caspase)途径及caspase非依赖途径。凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor，AIF)在caspase非依赖途径的细胞凋亡中起关键作用[1]。AIF 凋亡途径是一种caspase非依赖凋亡途径，也是现阶段以线粒体为中心的细胞凋亡中的重要途径[2]，多发生于神经细胞、特殊类型肿瘤细胞等[3]。AIF作为氧化传递链中一种重要的黄素蛋白，广泛分布于线粒体内膜，成为AIF途径凋亡的发生基础[4]。

螺旋神经元细胞(spiral garglion neurons，SGNs)是耳蜗中重要的感觉细胞，在声信号转换及传导中起重要作用。螺旋神经元的损伤、凋亡，可以直接引起听力减退，内毛细胞向听觉中枢信号传递障碍，甚至可能导致听神经病的发生[5]。螺旋神经元损伤、凋亡过程中，兴奋性神经递质谷氨酸(Glu)发挥着重要作用，是噪声性聋、年龄相关性聋、部分难治性聋等感音神经性聋的重要病因[6]。然而，谷氨酸毒性损伤是否与AIF凋亡因子相关以及是否参与耳聋的发生，仍有待进一步研究。本实验采用体外培养螺旋神经元的方法，观察不同浓度谷氨酸损伤条件下，螺旋神经元中AIF的表达与分布状况，探讨谷氨酸促螺旋神经元凋亡的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用40只出生后0～3天SD大鼠螺旋神经元行体外培养，动物由第四军医大学实验动物中心提供，平均分为4组，分别为正常组：仅给予正常SGNs培养液培养；10 mM Glu组：按1:7分别加入80 mM谷氨酸液及SGNs培养液培养；20 mM Glu组：按1:3分别加入80 mM谷氨酸液及SGNs培养液培养；40 mM Glu组：按1:1分别加入80 mM谷氨酸液及SGNs培养液培养。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养 SD大鼠仔鼠以75%酒精消毒后，断头，头颅矢状位正中断开后去除周围组织，取出耳蜗，置于消毒超净台中，挑开听泡，去除血管纹、螺旋韧带，沿基底膜底撕除基底膜，保留螺氏管和中轴放置于培养液中，机械法裂解组织后，加入0.125%胰蛋白酶和0.125%胶原酶酶解组织，37 ℃条件下孵育30 min，玻璃管吹打组织，待2次Hanks液漂洗离心后，滤过膜过滤，加入细胞培养液4 ml，置于37 ℃ 5% CO2培养箱孵育，培养1天，第2天换液，加入Glu液和细胞培养液，培养48小时后于倒置显微镜下观察。

1.2.2螺旋神经元细胞的免疫荧光染色 培养48 h后细胞加4% 多聚甲醛固定30 min，0.1 M PBS漂洗3次，每次5 min；后加入0.3% TritonX-100打孔，常温下放置15 min，0.1 M PBS漂洗；加5%牛血清封闭，37 ℃孵育20 min；甩净液体后，标本滴加稀释后一抗(如1:100稀释后的AIF溶液或1:200稀释后的tublin溶液)，4 ℃冰箱中静置3天，0.1 M PBS漂洗；再于黑暗环境中滴加稀释后荧光二抗，4 ℃孵育1天，0.1 M PBS漂洗；1:1 000稀释的DAPI液衬核，常温下孵育10 min，0.1 M PBS漂洗，去除多余液体，滴加100 μl 85%甘油，封片，于荧光显微镜下观察，拍照。

1.2.3实时荧光定量PCR

1.2.3.1RNA提取 向培养48 h后的细胞中加300 μl RLTbuffer，匀浆，最大速度离心3 min，取上清液，加入300 μl 70%酒精，混匀；移至RNeasy Mini spin，8 000 r/min离心15 s；向RNeasy Mini spin加700 μl RWI buffer，8 000 r/min离心15 s；再次加入500 μl RPE buffer，8 000 r/min离心15 s，弃废液；重复上步骤，离心2 min；将RNeasy Mini spin置于新管中，全速离心1 min，加入30 μl Rnase free水，8 000 r/min离心2 min；将收集到液体重新加入离心柱重复离心，可提供RNA浓度。

1.2.3.2cDNA逆转录 步骤按QIAGEN逆转录试剂盒步骤，配制模板体系(14 μl)，42 ℃孵育2 min，置于冰上，再配制逆转录体系(20 μl)，42 ℃孵育30 min，95 ℃孵育3 min得cDNA，于-20 ℃保存。cDNA反应 按QIAGEN反应试剂盒步骤，配制反应体系，上机反应。管家基因(GAPDH)引物序列：R-GAPDH-F: TAGAACTCCAGATGGCAAGACA；R-GAPDH-R: CGCCAGTAGA CTCCACGACA；目的基因引物序列：R-AIF-F:TAGAACTCCAGATGGCAAGACA,R-AIF-R:AAGCCCACAATAAGGACTAACAC;R-caspase3-F:GAATGACTGGGAGTGGGGTAG,R-caspase3-R:GACCTGGAACATCGGATTTGA;R-calpgin-F:AAGCCCACAATAAGGACTAACAC,R-calpain-R: TAAGGGCGTCAGGTGTAAGGT。

1.3统计学方法 实验中的数据均为计量资料，故用均数±标准差来表示，运用SPSS17.0 和Excel软件对数据进行统计分析及图表绘制，组间两两比较采用单因素方差分析SNK-q 检验,α=0.05。

2 结果

2.1不同浓度Glu组SGNs的形态 体外培养SGNs 48 h后，光镜下观察，发现正常组细胞胞体呈梭形，周围可见光晕，双极伸出较长突起，细胞状态良好；10 mM Glu组神经元形态明显，双极突起延长，与正常组形态无明显变化；20 mM Glu组SGNs细胞轴突缩短明显，胞体可见透光点，SGNs形态变化明显；40 mM Glu组轴突消失，胞体皱缩，胞浆中透光明显，可见明显细胞损伤(图1)。

图1 体外培养48 h后各组螺旋神经元细胞形态图(×100)

a～d分别为正常组、10 mM Glu组、20 mM Glu组及40mM Glu组SGNs倒置显微镜下细胞形态，白色箭头示典型SGN细胞

图2 各组螺旋神经元TUNEL免疫荧光染色图(×600) 四组TUNEL染色细胞核，红色为TUNEL染色，蓝色为DAPI染色

图3 各组AIF免疫荧光分布图(×1 000)

Glu干预后的体外培养SGNs细胞行免疫荧光染色，AIF衬染为红色，DAPI衬核。白色箭头示AIF分布异常的SGNs细胞。a～d分别为正常组、10 mM Glu组、20 mM Glu组及40mM Glu组

2.2不同浓度Glu组SGNS TUNEL染色结果 荧光显微镜下观察发现，正常组中SGNS细胞核呈椭圆形，核质均匀，而TUNEL着色细胞核几乎不可见；10 mM Glu组胞核固缩明显，但TUNEL着色细胞核仍较少：20 mM Glu组可见明显细胞核固缩及明显的TUNEL着色；40 mM Glu组TUNEL着色细胞核进一步增加，细胞凋亡明显(图2)。

2.3免疫荧光观察AIF在SGNs中分布变化 正常组AIF均匀着色于胞浆及轴突，与细胞核界限分明，可见明显双极突起及胞浆着色；10 mM Glu组红色AIF开始与蓝色细胞核重叠，但核转位不明显；20 mM Glu组AIF不仅分布于双极轴突及胞浆，胞核也可见明显着色；40 mM Glu组螺旋神经元胞体皱缩，双极形态不可见， AIF在胞核分布明显(图3)。同一视野计数AIF分布于细胞核的细胞比率，结果发现，正常组未见AIF转位细胞，10 mM Glu、20 mM Glu和40 mM Glu组核转位细胞率分别为11.1%±4.8%、15.1%±1.4%和50.0%±5.6%，与正常组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，随谷氨酸浓度升高，AIF转位细胞数目增加。

2.4各组SGNs中AIF、calpain和caspase 3的表达变化 PCR结果显示，不同浓度Glu组AIF mRNA表达水平明显高于正常组(P<0.05)，从低浓度到高浓度Glu组，AIF mRNA表达水平呈下降趋势；Calpain mRNA表达水平在正常及10 mM Glu组之间无明显差异，在20 mM Glu组和40 mM Glu组中表达明显升高(P<0.05)。各组间caspase 3 mRNA表达水平无明显差异(P>0.05)，但随Glu浓度增加其表达量呈下降趋势(表1)。

表1 各组体外培养SGNs中AIF、calpain及caspase 3相对表达量

注：*与其他组相比，P<0.05

3 讨论

研究表明，噪声、缺血、缺氧、耳毒性药物等都可导致感音神经性聋，而谷氨酸(Glu)兴奋性毒性在其中发挥着重要作用。Glu兴奋性毒性可导致神经元长时程或短时程突触信号传导障碍[7]，可影响神经元的正常传输信号，从而引起神经元细胞的退行性病变或凋亡，这是螺旋神经元损伤的生理机制之一。在损伤条件下，兴奋性Glu可由毛细胞过多释放入突触间隙，与螺旋神经节内的SGNs细胞表面Glu受体结合，激活下游途径，导致氧化损伤或钙超载的发生，从而诱导SGNs的退行性病变或凋亡，导致感音神经性聋。而氧化损伤或钙超载，均可激活体内一系列损伤凋亡途径，与线粒体为中心的calpain-AIF途径相关[8]。本研究结果显示不同浓度Glu干预体外培养SGNs 48 h后，20 mM浓度谷氨酸即可诱导SGNs轴突缩短，胞体出现透亮光点；TUNEL凋亡染色结果提示随Glu浓度升高，细胞核固缩及细胞凋亡现象越来越明显，这与Steinbach等[9]发现高浓度Glu对SGNs有损伤作用一致。

耳蜗感觉细胞的损伤凋亡与caspase 3途径有一定相关性。Schmutzhard等[10]研究认为败血症引起重度听力损失的过程中，Corti器支持细胞caspase途径被激活，影响毛细胞的再生与修复；Abaamrane等[11]研究显示爆震性损伤中，caspase凋亡途径导致毛细胞减少，从而引起听力损伤发生；Steinbach等[9]应用caspase阻断剂z-VAD-FMK[z-Val-Ala-Asp(ome)-fluoromethy-lketone]可有效抑制SGNs轴突的缩短。但是单纯阻断caspase途径并不能有效抑制耳蜗感觉细胞损伤凋亡，说明耳蜗感觉细胞凋亡过程中可能存在其他凋亡途径，如：AIF凋亡途径，因此本研究探讨AIF途径在Glu损伤耳蜗感觉细胞中的作用。

AIF是正常线粒体中的一种黄素蛋白，存在于线粒体内膜上，在氧化传递链中有重要作用。AIF由三部分构成，包括黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinudeotide,FAD)结合序列、2个核定位序列及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinanide adenine dinudeotide,NAD)定位序列组成，生理状况下，N端通过特定线粒体定植序列(mitochondrial leading sequence,MLS)序列插入到线粒体内膜中[12]。目前认为，AIF凋亡途径是在凋亡信号诱导下，细胞内信号转导促进钙离子浓度升高，激活calpain蛋白，剪切定位于内膜的AIF，并通过线粒体传输孔道(pereabitily transition pore,PTP)孔释放AIF到胞浆[13]，AIF自胞浆转运至胞核可与限制性内切酶EndG等结合，裂解DNA分子成片段，促进细胞凋亡发生[14]。在皮层神经元培养的实验中，DNA修复酶(ploy ADP-ribose polymerase,PAPR-1)介导的兴奋性神经递质毒性，可诱导AIF进入细胞核[8]；给予SD大鼠130 dB SPL的白噪声2 h后，在基底膜染色铺片发现AIF核转位，且随AIF表达的上调，EndG表达亦上调，促进外毛细胞的凋亡[15]。本研究发现谷氨酸损伤SGNs作用过程中，有明显核转位的现象，而RT-PCR也发现不同浓度Glu组AIF mRNA表达水平明显高于正常组，说明AIF在Glu损伤SGNs的过程中有重要作用。而caspase 3在免疫荧光染色中未显色，各组mRNA表达水平也无差异，从而说明Glu损伤体外培养SGN过程中不存在caspase途径。

Calpain蛋白属于钙依赖蛋白家族，为非溶酶体性半胱氨酸蛋白酶，广泛存在于哺乳动物及其他物种中[16]，主要分布于胞浆，可被Ca2+激活，具有重要蛋白水解作用。有作者认为，calpain是AIF途径上游的主要作用蛋白，其被激活后，可通过线粒体外膜，剪切定位于内膜的AIF，并通过线粒体PTP孔释放AIF到胞浆[13]。本研究PCR结果显示高浓度谷氨酸组的calpain表达明显升高，提示螺旋神经元损伤过程中存在上述过程，说明calpain与AIF协同参与了谷氨酸对体外培养SGN的损伤凋亡，而AIF在细胞核的分布，也进一步验证了calpain-AIF途径主导SGNs的凋亡。

综上所述，本研究发现，Glu损伤体外培养的SGNs与calpain-AIF凋亡途径相关，而非caspase途径；提示可否通过抑制calpain抑制AIF途径，达到减少螺旋神经元凋亡、从而恢复听力的目的，为耳聋的防治提供了新的研究方向。

4 参考文献

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9 Steinbach S, Lutz J. Glutamate induces apoptosis in cultured spiral ganglion explants[J]. Biochem Biophys Res Commun,2007,357:14.

10 Schmutzhard J, Glueckert R, Pritz C, et al. Sepsis otopathy: experimental sepsis leads to significant hearing impairment due to apoptosis and glutamate excitotoxicity in murine cochlea[J]. Dis Model Mech,2013,6:745.

11 Abaamrane L, Raffin F, Schmerber S, et al. Intracochlear perfusion of leupeptin and z-VAD-FMK: influence of antiapoptotic agents on gunshot-induced hearing loss[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol,2011,268:987.

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