冠心病心绞痛寒凝血瘀证动物模型的建立*

王 朋，杨明会，李绍旦，霍 旺，刘 毅，张俊修

(1.北京中医药大学第一临床医学院，北京 100700;2.解放军总医院中医研究所，北京 100853)

冠心病心绞痛是临床常见病、多发病，严重威胁人群健康。据临床流行病学调查研究显示，寒凝血瘀证是本病的常见多发证型，给患者带来极大的痛苦[1]，因此开展冠心病心绞痛寒凝血瘀证的基础研究，具有临床现实意义。本研究拟采用垂体后叶素单一因素大剂量静脉注射的方法，建立冠心病心绞痛寒凝血瘀证病证结合模型，并对该模型从宏观体征、心电图、心肌微循环等方面进行观测，以综合评价该模型的证候属性。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

垂体后叶素注射液pit(6 U/ml，南京新百药业有限公司，批号111204)，乌拉坦(国药集团化学试剂有限公司，批号T20111110)，TXB2放射免疫试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司，批号20121025)，6-Keto-PGF1α放射免疫试剂盒(北京普尔伟业生物科技有限公司，批号20121025)。

MP-100多导生理记录仪(美国BIOPAC公司)，MC-142L欧姆龙电子体温计(欧姆龙大连有限公司)，ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)，BX51WI正立微循环显微镜(Olympus公司)，SN-697B自动γ放射免疫计数器(上海原子核研究所日环仪器厂)，1-15k离心机(德国Sigma公司)。

1.2 动物与分组

健康雄性SD大鼠40只，体质量220±20 g，由军事医学科学院实验动物中心提供(动物合格证号SCXK-(军)2007-004)。将大鼠按随机数字表法分为2组，即正常组和模型组，每组20只。

1.3 造模方法

大鼠用20%乌拉坦5 ml/kg腹腔注射进行麻醉，仰卧位固定于鼠台上，连接生理记录仪，记录大鼠标准Ⅱ导联心电图。大鼠经口气管插管，连接小动物呼吸机。解剖并分离出股静脉进行静脉置管。准备完毕后，模型组注入垂体后叶素 6 U/kg[2](浓度为2 U/ml)，5 s恒速注射完毕，正常组注射等量生理盐水，在造模后30 min按照下述方法观测各项指标。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 体温 将电子体温计插入大鼠肛门约2 cm处，直到电子体温计数值稳定，读取屏幕数据。

1.4.2 心电图指标 记录造模后30 min内标准Ⅱ导联心电图，以QRS波群的终点与ST段交接处的J点位移判断心肌缺血发生与否，并以PR段为基线记录J点位移，以J点上升或下降≥0.1 mV视为发生心肌缺血心绞痛[3]，同时记录大鼠心率变化。

1.4.3 微静脉管径及红细胞流速 大鼠取平卧位开胸暴露心脏，置于正立显微镜载物台上，在外落射光源照明下，观察心肌微循环变化。打开连接在显微镜上的高速摄像机以500 F/s的速度记录心肌表面的微循环动态图像，再以25F/s的速度重放高速记录的图像。将视频资料转化为图像文件，采用Image-Pro Plus 5.0图像分析软件测定微静脉管径和红细胞流速，以造模前的数值作为基准值，结果用各时间点的数值与基准值比值来表示[4]。

1.4.4 血浆 TXB2、6-Keto-PGF1α腹主动脉采血3ml注入EP管，预先加入消炎痛-EDTA.Na2液0.2 ml，颠倒混匀，4℃3500 rpm离心15 min，分离血浆，放射免疫法测定TXA2、PGI2的稳定代谢产物TXB2、6-Keto-PGF1α，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.5 统计学方法

应用SPSS 17.0统计软件行统计分析，定量数据以均数±标准差(s)表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体征

正常组大鼠唇周、爪子、耳壳、尾巴颜色淡红，温度正常，大便成形;模型组大鼠唇周、爪子颜色紫暗，爪温下降，耳壳、尾巴变白发凉，大便湿烂，其中有2只大鼠造模后有大量粉红色泡沫样液体从鼻腔内流出，继而死亡。

2.2 体温

表1显示，与正常组比较，模型组大鼠体温在造模前差异无统计学意义(P＞0.05)，造模后体温降低差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 心电图

表2显示，与正常组比较，模型组大鼠J点在造模前差异无统计学意义(P＞0.05)，在造模后J点位移显著增加(P＜0.05)。模型组大鼠造模后心率减慢，与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。

表1 大鼠造模前后体温测定比较(s)

表1 大鼠造模前后体温测定比较(s)

注:与正常组比较:*P ＜0.05

组 别 例数 造模前(℃)造模后(℃)10 36.78±0.53 36.72±0.81模型组 10 36.89±0.66 35.88±0.74正常组*

表2 大鼠造模前后心电图变化比较(s)

表2 大鼠造模前后心电图变化比较(s)

注:与正常组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组心率(次/分)别 例数 J点位移(mv)造模前 造模后 造模前 造模后正常组10 0.033±0.013 0.031±0.015 438±52 440±56模型组 10 0.036±0.017 0.178±0.029*441±55 352±40＊＊

2.4 大鼠造模前后微静脉管径和红细胞流速变化比较

表3显示，与正常组比较，模型组大鼠心肌微静脉收缩，管径明显减小，红细胞流速减慢，差异有统计学意义(P＜0.05)。

表3 大鼠造模前后微静脉管径和红细胞流速变化比较(s)

表3 大鼠造模前后微静脉管径和红细胞流速变化比较(s)

注:与正常组比较:*P ＜0.05

组例数 管径 流速正常组别10 1.00 1.00模型组 10 0.90±0.07* 0.89±0.05*

2.5 大鼠造模后血浆TXB2、6-Keto-PGF1α变化比较

表4显示，与正常组比较模型组血浆TXB2水平显著升高，6-Keto-PGF1α水平降低，TXB2/6-Keto-PGF1α值显著升高，差异有统计学意义(P＜0.05或P ＜0.01)。

表4 大鼠造模后血浆TXB2、6-Keto-PGF1α变化比较(s)

表4 大鼠造模后血浆TXB2、6-Keto-PGF1α变化比较(s)

注:与正常组比较:*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别例数TXB2(pmol/L)6-Keto-PGF1α(pmol/L)TXB2/6-Keto-PGF1α 10 117.9±24.14 414.80±61.00 0.29±0.06模型组 8 236.9±41.32＊＊ 312.54±55.37* 0.75±0.13正常组＊＊

3 讨论

证候的研究是中医理论和临床研究的核心与关键问题。由于证候多依附于某种疾病，二者紧密联系，因此在辨证论治的同时也需要进行辨病，即辨病辨证相结合。证候动物模型是研究中医证候本质与规律的重要工具，其中的病证结合模型便是辨病与辨证相结合方法在证候动物模型上的具体体现。由于其同时具有西医疾病的特点和中医证候的特征，符合临床实际，因此在中医药基础研究中得到广泛的认可和推广[5]。

目前病证结合模型多是根据西医理论塑造疾病模型，根据中医理论施加人为干预因素塑造证候模型，再把二者结合起来，利用这种叠加方法建立的模型病与证干预因素相互影响，其模型的稳定性和可靠性无法保证[6]。因此，有学者[7]提出了新的研究思路，即在西医疾病模型的基础上，不施加人为干预因素，观察并检测模型动物的宏观表征和微观指标，综合上述结果进行证候属性判定。这种按照临床诊疗思路构建的模型客观性强、可信度高，更贴近于临床实际。本研究正是基于这种思路，采用单一药物因素作为病证结合模型疾病与证候共同的造模因素，探索建立冠心病心绞痛寒凝血瘀证病证结合动物模型，并对其进行证候评价。

3.1 冠心病心绞痛动物模型建立

垂体后叶素(pituitrin，pit)是从动物脑垂体中提取的物质。研究证实，过量的pit静脉注射可引起冠状动脉较长时间强烈痉挛，同时使全身小血管收缩，外周负荷加重，心肌耗氧量增加，从而引起急性心肌缺血，导致急性心绞痛的发作[8]。本研究采用垂体后叶素6U/kg大剂量股静脉注射的方法建立动物模型，通过观察其心电图变化发现，在造模后30 min ST段显著抬高且大于0.1mV，符合急性心肌缺血心电图的典型变化，说明冠脉痉挛性心绞痛动物模型建立成功[9]。

3.2 寒凝血瘀证动物模型的评价

中医“证”的动物模型，应符合中医病因学说和辨证诊断规律。研究表明[10，11]，垂体后叶素大剂量造模具有明显的寒邪致病特点。本实验采用垂体后叶素静脉注射造模，不仅在病因上符合中医理论，而且符合临床急性心绞痛寒邪直入心脉的发病特点。

症状和体征是辨识证候的主要依据。临床上冠心病心绞痛寒凝血瘀证发病时常表现为手足不温、厥冷，胸痛如绞，口唇、爪甲青紫，舌紫暗。本研究首先通过观察比较大鼠造模前后一般状况的变化，来获取大鼠的宏观体征和诊断信息，再运用中医理论进行综合辨证分析，确定模型的证候属性。实验中我们观察到，模型组大鼠唇周、爪子颜色紫暗，爪温下降，耳壳、尾巴变白发凉，大便湿烂，心率减慢，这些均符合中医寒凝血瘀证候表现。

微观理化指标是辨识证候的辅助和有效补充。本研究借助现代技术检测手段，从器官、细胞、分子水平获取信息，在较深层次上对模型进行微观辨证。心电图变化是反映心肌缺血与否的直观指标，微静脉管径和红细胞流速是反映心肌微循环情况的有效指标。TXB2、6-keto-PGF1α是 TXA2与 PGI2的稳定代谢产物。TXA2与PGI2是一组由血管内皮细胞合成并释放的血管活性物质，TXA2能促进血管收缩和血小板聚集，PGI2能舒张血管，抑制血小板聚集，二者相互拮抗，在生理状态下血浆中二者的浓度比值相对平衡，从而维持适当的冠脉张力和血小板内环境稳定[12]。

本研究结果显示，与正常组比较，模型组大鼠体温下降，心率减慢，心电图表现为心肌缺血;心肌微静脉收缩，红细胞流速明显减慢，TXB2/6-Keto-PGF1α值显著升高(P＜0.05或P＜0.01)。综合分析微观理化指标后我们认为，这些变化符合寒凝血瘀证的微观表现。寒为阴邪，直入心脉，损伤心阳，心阳无力鼓动血液运行，故见体温下降、心率减慢、心肌缺血等“寒邪伤阳”表现;“寒性收引、凝滞”，寒邪内侵，引起心脉绌急、气血凝滞，故在微观视野中相应地表现为心肌微血管收缩、红细胞流速减慢等微循环障碍等血瘀表现;TXA2/PGI2的失衡被认为是血瘀证的特征之一[13]，寒邪入脉，血管收缩，损伤血管内皮，致使PGI2等抗凝抗栓物质的生成释放减少，而TXB2等促凝促栓物质生成释放增加，二者失衡可导致血管痉挛加重、血小板聚集、血栓形成等病理改变，使得血行障碍而为寒凝血瘀证。

综上所述，通过对模型宏观表征和微观指标的辨证分析，我们认为大鼠冠心病心绞痛寒凝血瘀证模型成功建立。该模型既符合现代医学疾病病理变化特点，也符合中医证候特征，可靠性及稳定性较好。本实验借助现代医学的先进技术，对寒凝血瘀证模型进行深层次微观辨证的同时，在一定程度上也是对证候的物质基础和变化实质的深入阐释。该模型的成功建立对于中药药效的评价和中药作用机理的研究颇有意义，能更好地为临床诊疗服务。

[1]郭志华.冠心病心绞痛2432例中医辨证分型综合统计分析[J].湖南中医杂志，1998，14(2):7-8.

[2]李明磊，王华，陈泽斌.电针内关穴对急性心肌缺血大鼠心电图及超微结构的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志，2007，5(8):708-710.

[3]周琼，陆大祥，付咏梅，等.甘氨酸对小鼠心肌缺血性损伤的防治作用研究[J].中国病理生理杂志，2002，18(4):360-362.

[4]Li J，Lang MJ，Mao XB，Tian L，Feng YB.Antiapoptosis and mitochondrialeffectofpioglitazone preconditioning in the ischemic/reperfused heart of rat[J].Cardiovasc Drugs Ther，2008，22:283-291.

[5]纪冬琛，李昌煜.病证结合动物模型的制作、评价与展望[J].浙江中医药大学学报，2010，34(4):615-617.

[6]黄碧燕.关于病证结合动物模型研究现状的思考[J].中国中医药信息杂志，2010，10(9):79-80.

[7]刘涛，王伟.证候动物模型研究的思索[J].中华中医药杂志，2006，21(9):550-551.

[8]Arndldo Pinelli，Silvio Trivulzio，Livio Tomasoni，et al.Cardiac necrosis markers associated with low nitric oxide levels in the plasma of rabbits after treatment with vasopressin:protective effects of nitroglycerin administration[J].Pharmacol Res，2002，45:427-431.

[9]施新猷，顾为望.人类疾病动物模型[M].北京:人民卫生出版社，2008:121-122.

[10]卫洪昌，尚正录.大鼠垂体后叶素致心肌缺血模型中医证型的反证研究[J].中国病理生理杂志，2005，21(8):1639.

[11]张明雪，曹洪欣.冠心病心阳虚证动物模型的制作[J].中国中医基础医学杂志，2002，8(4):71-75.

[12]Yang Liu， Gong Meifang. Influence of Decoction of Huoxuetongmai on Changes of Plasma TXB2and 6-Keto-PGF1αLevels During Cerebral Ischemia Reperfusion Injury in Rats[J].Journal of Chinese Microcirculation，2006，10(1):36-38.

[13]时晶，田金洲，王永炎，等.血瘀证的生物学基础研究[J].中华中医药杂志，2006，21(6):363-364.