流动注射-化学发光法快速灵敏测定孔雀石绿*

张 韫，高苏亚

(西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

孔雀石绿(Malachite green)又名孔雀绿、苯胺绿和盐基块绿，分子式为C23H25ClN2，是一种三苯甲烷类染料(Tryphenyl Methane Dyestuffs)。因其既可防治鱼类的水霉病、烂鳃病、小瓜虫病等寄生虫病，又可用于水产品保鲜，所以曾在水产养殖业中广泛使用[1]。

孔雀石绿的官能团为三苯甲烷，具有致癌、致畸和致突变等副作用[2]，对人类的生命健康产生严重威胁。农业部颁布的中华人民共和国农业行业标准无公害食品渔用药物使用准则(NY5071—2001)中明确提出孔雀石绿为禁用药物[3]。美国等国家也在Council Directive 96/23/EC中指出孔雀石绿为B类禁用药物不得检出。由于孔雀石绿价格低廉，一些不法渔民仍在使用，由此引起的水产品残留和相关环境污染问题不容忽视。

目前孔雀石绿常用的检测手段有高效液相色谱法[4]、液相色谱-质谱联用法[5]、分光光度法[6]、共振瑞利散射法[7]、酶联免疫分析法[8]和化学发光法[9]等。流动注射与化学发光联用技术具有灵敏度高、线性范围宽和分析速度快等优点，在化学、生命科学及环境监测等领域具有广阔的应用前景。鲁米诺是目前应用最广的化学发光剂，据报道牛血清白蛋白对鲁米诺化学发光具有增敏作用，并依此构建了鲁米诺-牛血清白蛋白化学发光体系[10]。作者以孔雀石绿对鲁米诺-牛血清白蛋白体系发光信号的抑制作用为基础，建立了流动注射-化学发光测定纳克级孔雀石绿的新方法，并成功用于鱼塘水样和海鲜储存水样中孔雀石绿的分析测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪：西安瑞迈分析仪器有限责任公司。实验所用试剂均为市售分析纯，实验所用超纯水为二次去离子水，经过艾柯KLZ-UV系列超纯水机(成都唐氏康宁科技发展有限公司)纯化(电阻率18.3 MΩ)。强酸型阳离子交换树脂001×7(732)和强碱型阴离子交换树脂201×7(717)购自西安浩宇化工原料公司。鲁米诺(纯度≥97%)、牛血清白蛋白(分子量～66.43 kDa)、孔雀石绿(纯度≥96%)：均购自Sigma-Aldrich公司，c(鲁米诺储备液)=2.5×10-2mol/L，c(牛血清白蛋白储备液)=5.0×10-5mol/L，ρ(孔雀石绿储备液)=1.0×10-3g/mL，以上储备液均于4 ℃保存。

1.2 实验方法

流动注射-化学发光法测定孔雀石绿的实验装置示意图见图1。实验装置由4条管路组成：鲁米诺(NaOH)、牛血清白蛋白、载液(超纯水)和孔雀石绿样品溶液；蠕动泵流速为2.0 mL/min。基线稳定后由六通阀注入的100 μL鲁米诺与牛血清白蛋白和孔雀石绿样品液的混合液再混合，并在碱性条件下流入流通池，所产生的化学发光信号由光电倍增管(HV：750V)检测再经数据分析系统记录处理。

图1 流动注射-化学发光法测定孔雀石绿的实验装置示意图

2 结果与讨论

2.1 实验条件优化

实验考察了鲁米诺溶液浓度在5.0×10-7～5.0×10-4mol/L对体系发光信号的影响。当浓度为2.5×10-5mol/L时化学发光信号强而稳定，故以此浓度作为鲁米诺的实验浓度。

鲁米诺在碱性条件下发光量子效率较高。因此在鲁米诺中加入NaOH提高发光反应的灵敏度。鲁米诺浓度为2.5×10-5mol/L时，对NaOH浓度在1.0×10-3～1.0×10-1mol/L进行了实验。结果表明NaOH浓度为2.5×10-2mol/L时鲁米诺化学发光体系的信号达到最大值，故选择NaOH的实验浓度为2.5×10-2mol/L。

研究表明牛血清白蛋白可以增敏鲁米诺体系化学发光反应[10]。本实验考察了牛血清白蛋白在1.0×10-9～1.0×10-7mol/L对体系的影响。随着牛血清白蛋白浓度增大，发光信号增强，当浓度为5.0×10-9mol/L时发光信号逐渐趋于稳定。故选择牛血清白蛋白的实验浓度为5.0×10-9mol/L。

实验对混合管长度和溶液流速分别在9～19 cm和0.5～5 mL/min范围内进行了优化。综合溶液混合效果及发光强度等因素，选定2.0 mL/min流速和10.0 cm混合管长度作为最佳实验条件。

2.2 反应体系化学发光强度-时间关系

在流动注射系统中对鲁米诺-牛血清白蛋白-孔雀石绿的发光行为进行了考察，见图2。牛血清白蛋白、鲁米诺和NaOH浓度分别为5.0×10-9、2.5×10-5和2.5×10-2mol/L。鲁米诺体系在4.4 s(tmax)发光强度达到最大值(Imax)130，且发光信号在15 s内消失(曲线1)；当流动注射系统中加入牛血清白蛋白时，鲁米诺的Imax从130增加至405，相应tmax从4.4 s缩短至4.0 s(曲线3)；当10 ng/mL 孔雀石绿存在时Imax从405降低至252，而tmax不变(曲线2)。

t/s图2 不同化学发光体系的化学发光强度-时间曲线

2.3 化学发光体系的稳定性考察

考察了不同浓度孔雀石绿存在下鲁米诺-牛血清白蛋白化学发光体系的稳定性。将100 μL鲁米诺注入流动注射分析系统，记录化学发光强度测试不同体系的稳定性。实验持续3 d，系统每天运行8 h，结果列于表1。每个结果为7次进样测定平均值，RSD均小于2.5%，可见各发光体系稳定性良好。

表1 流动注射-化学发光体系的稳定性测试

2.4 测定的线性范围和检出限

实验发现孔雀石绿能显著猝灭鲁米诺-牛血清白蛋白体系的发光反应，且发光信号的降低值和孔雀石绿浓度对数值在0.03～1 000 ng/mL存在良好的线性关系，线性方程为ΔI=27.9Lnρ + 135.4(ρ：ng/mL)，相关系数R=0.996 1，检出限为0.01 ng/mL(3σ)。在流速2.0 mL/min条件下，完成一次测定(包括进样和冲洗管路)仅需30 s，采样频率可达120次/h。

2.5 干扰实验

2.6 样品分析

用于鱼塘水和海鲜存储水样中孔雀石绿的测定。取西安市周边鱼塘水样和市场海鲜存储水样各100 mL，用0.45 μm滤膜过滤，所得滤液经强酸型阳离子交换树脂和强碱型阴离子交换树脂处理。在处理过的水样中加入适量孔雀石绿标准溶液制成模拟样品。待混合均匀后，将模拟样品稀释到线性范围，采用标准加入法测定孔雀石绿的含量。结果分别列于表2和表3，每个数据为7次测定结果的平均值，回收率为97.1%～103.8%，RSD小于4.0%(n=7)。

表2 鱼塘水样中孔雀石绿的测定

表3 海鲜储存水样中孔雀石绿的测定

续表

3 结 论

以孔雀石绿对鲁米诺-牛血清白蛋白体系化学发光体系的抑制作用为基础，建立了超灵敏测定孔雀石绿的流动注射-化学发光分析法。具有分析速度快、灵敏度高、试剂消耗少和仪器装置简单等优点，适用于环境水样中孔雀石绿的分析测定。

[ 参 考 文 献 ]

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[3] 中华人民共和国农业部.NY5070—2001无公害食品标准水产品中渔药残留限量[S].北京：中国标准出版社，2001：1-4.

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