豫西地区犬巴贝斯虫病及媒介流行病学特征

2014-06-07尚泽松张振芳爨淑楠杨自军

河南科技大学学报(自然科学版) 2014年4期

关键词：血红豫西虫病

尚泽松，张才，张振芳，爨淑楠，杨自军

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

豫西地区犬巴贝斯虫病及媒介流行病学特征

尚泽松，张才，张振芳，爨淑楠，杨自军

（河南科技大学动物科技学院，河南洛阳 471003）

为研究河南省西部地区犬巴贝斯虫病的流行情况及媒介蜱虫中巴贝斯虫的携带率，分别运用血液涂片及聚合酶链式反应的方法对豫西地区2 960只犬和813只蜱虫进行抽样调查。运用体式显微镜对蜱进行形态学观察，将部分聚合酶链式反应阳性产物进行测序分析，鉴定虫株。研究结果显示：豫西地区有犬巴贝斯虫病发生，犬患病率为3.41%；聚合酶链式反应测序结果均为吉氏巴贝斯虫基因序列；蜱虫的形态学观察结果显示：蜱虫以镰形扇头蜱为主（52.4%），血红扇头蜱略少，蜱虫带虫率为2.33%。

巴贝斯虫病；犬；蜱；聚合酶链式反应

0 引言

巴贝斯虫病是一种蜱传性血液原虫病，能引起动物及人类患病的传染性疾病［1－2］，患病犬临床症状主要表现为发热、贫血和血红蛋白尿。较为严重的巴贝斯虫感染，可以通过显微镜检查血涂片来确诊，血涂片法也是最常用的判定巴贝斯虫病的方法［3－4］。大多数巴贝属寄生虫被认为是具有宿主专一性，但有些虫体也能交叉感染，甚至引起人类发病［1］。有研究显示：野生动物患巴贝斯虫病多为隐性，貂羚、细斑马、黑犀牛中均有巴贝斯虫病例出现，且多出现杂交，但在家养动物中则较易出现阳性病例［4］。有资料显示：在河南省传播本病主要是硬蜱中的血红扇头蜱、镰形扇头蜱和长角血蜱。本病具有明显的季节性，多发生在湿热蜱虫活动较频繁的季节。中国已报道的犬巴贝斯虫病是由吉氏巴贝斯虫引起的，在江苏和河南的部分地区呈地方性流行，对犬危害严重［5－11］。检测犬巴贝斯虫的常见方法有血涂片法、临床治疗法以及聚合酶链式反应（PCR）方法等。血涂片检测较为简单，但是不易发现虫体，易造成漏诊；临床治疗法是对症治疗用杀虫净杀死虫体，易于观察到疗效，但在未表现临床症状的早中期很难发现感染病例，且大多数杀虫药有毒性，用量过多会对犬的健康造成伤害；PCR检测则比较准确、灵敏，但需要特殊设备。巴贝斯虫病给中国畜牧业带来危害，也给犬只健康造成极大的伤害。因此，本文主要研究犬巴贝斯虫病的感染率、死亡率及传播途径，并查清宠物犬体表寄生的硬蜱感染情况，为进一步了解豫西地区犬巴贝斯虫病流行状况及优势虫株提供重要依据。

1 材料与方法

1.1 样品来源

调查对象来自各市区动物医院就诊的犬只及犬场犬只，其中，洛阳1 322份、三门峡735份、平顶山903份，调查动物医院及犬场中犬巴贝斯虫病的发病率。本次共调查门诊病例和犬场犬只2 960只，制备相应的血液涂片。

1.2 主要试剂

rTaq酶、dNTP、2000 DNA Marker、TakaRa全血基因提取试剂盒、TakaRa基因纯化试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，吉姆萨染液购自Sigma公司。琼脂糖购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.3 犬血涂片的染色镜检

将自然干燥的血涂片用甲醇固定1～2 min，用吉氏染液染色后，用蒸馏水冲洗染液并用吸耳球将血涂片吹干或自然干燥。

1.4 犬巴贝斯虫的PCR检测

按宝生物工程（大连）有限公司提供的操作说明，根据10∶1的比例随机抽检各市区的犬血样品293份，血液样品分别提取犬全血基因组DNA。根据已经建立的PCR诊断方法［12］检测犬巴贝斯虫病，以犬血液中提取出的基因组DNA作为PCR模板。PCR反应体系为50 μL，包括：上、下游引物各1 μL，10× PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，DNA模板1 μL，rTaq酶0.3 μL，双蒸水（ddH2O）37.7 μL。反应结束后取5 μL PCR产物在1.0%（1 g琼脂溶于100 mL TBE缓冲溶液）EB染色的琼脂糖凝胶上电泳。电泳后，紫外灯下观察结果。随机抽取30例观察到阳性结果的PCR产物，纯化回收扩增片段、送至华大基因进行测序、鉴定该巴贝斯虫的种类。

1.5 犬体表蜱虫的初步调查

调查中共采集蜱虫813只，用SZM系列体式显微镜进行形态学观察，观察蜱虫的假头、肛侧板、眼、气门、副肛侧板、缘垛等部位，参照文献［7－8］进行鉴定并区分蜱虫的种类。然后，对采集的蜱虫随机采样调查，将蜱虫进行液氮研磨，提取组织DNA，用已建立的PCR诊断方法［12］计算蜱虫的带虫率。

2 结果

2.1 犬血液涂片染色镜检

将犬血样进行吉姆萨染色后镜检结果（见表1）。总计镜检观察到25例阳性病例，占总数的0.84%。

2.2 犬血液基因组DNA的PCR检测

用已建立的PCR诊断方法［12］对293份样品进行检测。PCR产物电泳结果显示：有阳性条带出现，且与阳性品同在319 bp，阴性对照无条带出现。测序结果显示：送检样品基因序列均与基因库中吉氏巴贝斯虫序列100%相匹配。调查结果如表1所示，PCR检测出豫西地区犬巴贝斯虫感染率为3.41%，镜检感染率为0.84%，部分电泳图片如图1所示。

表1 豫西地区犬巴贝斯虫病的流行情况

图1 犬巴贝斯虫特异性引物的PCR扩增部分结果

2.3 巴贝斯虫在全年调查中感染情况

2013年，在豫西地区巴贝斯虫的感染情况如表2所示。由表2可看出：5～10月份巴贝斯虫感染犬的病例数相对较多，6月和9月为高发期，且犬场中的感染情况低于动物医院就诊犬的感染情况。

表2 2013年在豫西地区巴贝斯虫的感染情况例

2.4 蜱虫形态观察及带虫率

图2～图5为在犬只体表发现的蜱虫。其中，图2和图3为血红扇头蜱。由图2可见：该蜱为雄蜱，假头基为六角形、有缘垛等。图3为腹面图像，由图3可以明显看出：肛侧板近似三角形，副肛侧板锥形，末端尖细、内缘中部稍凹，且气门板为逗点状，判定为血红扇头蜱。图4和图5为镰形扇头蜱。由图4可见：该蜱虫为雌蜱。由图5可以看出：内缘中部稍凹，其下方凸角明显，判定为镰形扇头蜱。调查结果显示：813只蜱虫中，血红扇头蜱为387只，占总数的47.6%；镰型扇头蜱为426只，占总数的52.4%。然后，对采集的蜱虫随机采样调查，将蜱虫进行液氮研磨，用已建立的PCR诊断方法进行诊断，诊断结果显示：19只蜱虫中含有犬吉氏巴贝斯虫DNA，蜱虫带虫率为2.33%。

图2 血红扇头蜱背面

图3 血红扇头蜱腹面

图4 镰形扇头蜱背面

图5 镰形扇头蜱腹面

3 讨论

河南省西部地处丘陵和山区，夏秋季节温热潮湿，蜱虫滋生较为严重。作为人畜共患传染性的巴贝斯虫病，在河南西部地区发生较为广泛，给豫西地区犬只饲养行业带来极大的危害，也给宠物主人带来精神上的打击。文献［11］曾捕捉到河南地区多种类别的蜱虫，如长角血蜱、微小牛蜱、小亚璃眼蜱、血红扇头蜱、残缘璃眼蜱等，研究认为长角血蜱为优势种，且其密度随季节变化［11］；据有关资料记载，传播犬巴贝斯虫病媒介主要是血红扇头蜱、镰形扇头蜱和长角血蜱［7］。本文调查观察到仅有血红扇头蜱和镰形扇头蜱两种，这与文献［10］在上海市犬体表媒介蜱寄生情况初步调查中的结果相似，但这与文献［11］报道的长角血蜱是河南省的优势品种不一致，这至少说明了长角血蜱在传播犬巴贝斯虫病方面不是优势种。研究中运用已建立的PCR诊断方法检测蜱虫中的带虫率为2.33%，略低于巴贝斯虫病的感染率，这可能是因为蜱虫来源不同造成的，蜱虫一部分来自犬只生活的草地，另一部分来自犬表皮。

犬巴贝斯虫病的发生与传播媒介蜱虫直接相关。调查中发现犬场中巴贝斯虫病发病率低于动物医院就诊犬只的发病率，发现多数患病的犬只喜欢在草地玩耍，尤其以靠近山区或丘陵者较为多发。一般而言，蜱多在春季开始出现，冬季消失，一年内均有发生，但是观察得到该病高发期大致在6月份至9月份，这应该与豫西地区气候环境有关，本身就温热的林区和草地。在6月份及9月份下雨较多的情况下，更利于蜱虫的繁殖活动，所以该病的患病趋势与蜱虫的活跃程度呈正相关。其他月份也有病例零星出现，据了解这些病例均为有患病史的犬。文献［1－2］认为虽然有许多巴贝斯属虫体有宿主专一性，但是也有多宿主性的虫体存在，在调查中发现，在犬与羊共同生存的区域，犬只也有类似巴贝斯虫病的症状出现，虽然镜检及PCR检测未能检测到虫体，但按犬巴贝斯虫病的治疗方案可治愈，这很有可能是由于犬感染了其他种属的巴贝斯虫所致。文献［4］在研究有袋类动物巴贝斯虫病时提出，在雄性袋鼠中巴贝斯虫病患病率与交配后的生理应激有关。查访中发现，雄性犬大多数是在剧烈运动后发病，特别是配种后，这与文献［4］的观点基本一致。同时在调查中发现，纯种犬和引进犬最易发生犬巴贝斯虫病，且本地杂交犬对本病有较强的抵抗力，这可能是因为杂交优势和长期适应的共同作用结果；还有一些犬周围没有蜱虫活动也出现巴贝斯虫病临床症状，原因可能是：一是犬巴贝斯虫病可通过胎盘而垂直传播［9］，导致刚出生的幼犬携带有虫体，另外因为人工喂养，使幼崽无法吸收母乳中的抗巴贝斯虫病抗体而发病；二是通过血液水平传播，如比特犬经常咬斗，伤口直接接触，或者犬只失血过多进行血液输血治疗时均会导致虫体直接进入健康犬只血液中，进而感染巴贝斯虫。所以，预防犬巴贝斯虫病可从以下几个方面着手：首先，避免宠物犬到蜱虫活跃的草地、树林活动，尤其是5～10月份蜱虫活动频繁的季节。其次，要及时清理犬场内杂草，必要时对环境进行灭虫。再次，每天尽量检查一次犬只周身，做到尽早发现犬只身上的蜱虫，尽早驱虫。最后，运用分子生物学方法对犬只及供血犬进行每一阶段的检疫，达到早发现早治疗的目的。

诊断该病常用的方法有血涂片检测法、临床治疗法及PCR法。本次调查中3种方法均有应用，统计分析中发现，三者有一定的交叉，但是也存在一定的差异。血涂片检测较为简单，但是不易发现虫体，易造成漏诊；临床治疗法是对症治疗用杀虫药杀死虫体，易于观察到疗效，但在未表现临床症状的早中期很难发现感染病例，且大多数杀虫药有毒性，用量过多会对犬的健康造成伤害；PCR检测则比较准确、灵敏，但需要特殊设备。为保证诊断的准确性，建议使用两种以上的诊断方法来确诊该病。治疗时可以依据血液中的红细胞含量高低，进行营养支持或输血疗法等治疗方法来提高免疫力，但不能以血液中红细胞损坏程度来判定巴贝斯虫病的临床症状表现的严重性［3］，应综合考虑犬只的肝脏和肾脏功能判定犬患病的严重程度。到目前为止，还未研制出能完全治愈巴贝斯虫病的药物，一般采用保肝药和营养药配合治疗，减少犬只活动量，提高免疫力，最终达到带虫免疫的效果。

总之，犬巴贝斯虫病在豫西地区广泛流行，从而严重威胁豫西地区犬只的健康，所以，兽医及饲养犬只的人员应有所警惕，加强对犬巴贝斯虫病及媒介蜱的防控。

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S855.9

1672－6871（2014）04－0073－04

国家自然科学基金项目（31001058）；国家级大学生创新训练计划（201210464024）；河南科技大学SRTP项目（2012238，2013249）