川乌抗肿瘤初步研究

黄秀曼,刘迎辉,杜钢军*

(1.南阳市第一人民医院临床医学科,河南南阳473000;2.河南大学药学院药物研究所,河南开封475004)

川乌抗肿瘤初步研究

黄秀曼1,2,刘迎辉2,杜钢军2*

(1.南阳市第一人民医院临床医学科,河南南阳473000;2.河南大学药学院药物研究所,河南开封475004)

目的 初步研究川乌的抗肿瘤作用。方法 体内实验:建立小鼠肝癌H22皮下移植动物模型,灌胃给药后测定原位肿瘤体积、质量及免疫器官指数;体外实验:用MTT法测定川乌对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的影响。结果 体内实验:在本实验剂量下,与模型组比较,川乌组肿瘤生长减缓,抑瘤率为32.05﹪,胸腺指数、脾脏指数均升高;体外实验:实验所用浓度的川乌对小鼠肺癌细胞有生长抑制作用。结论 川乌有一定抗肿瘤作用。

川乌;H22;Lewis;MTT

癌症是仅次于心血管疾病导致人类死亡的另一个主要杀手,且发生率呈逐年上升趋势。中医作为中国传统文化的一部分已有几千年的历史,《华佗神医秘传》中就有关于乳岩的记载:“岩”反复连结,根深蒂固,虽在表皮,连生内脏。手术或放疗皆属局部性的治疗,药物治疗因具全身治疗优势而成为中晚期肝癌常用的治疗方法[1]。在常规的化学药品治疗过程中,昂贵的费用以及严重的毒副作用,给患者带来极大的经济负担以及身体的损害。拥有高选择、强活性、低毒副作用的中草药,在对抗肿瘤方面具有独特的优势。

川乌为毛茛科植物乌头的干燥母根。始载于《神农本草经》,列为下品,可祛风除湿、温经散寒、行淤止痛[2-3]。中药川乌来源于毛茛科植物乌头的干燥块根,其性热,味辛、苦,有大毒。现代药理研究表明,川乌的药理作用主要包括镇静、镇痛作用,局部麻醉作用,抗炎作用,对心血管系统有强心作用,对免疫功能有抑制作用,抗肿瘤作用等[4]。但因其毒性大,临床上常因用药不当而造成中毒甚至死亡。为指导临床正确使用川乌对肿瘤的治疗,我们对川乌的抗肿瘤作用做了初步研究。

1 材料

1.1 药品

川乌,购自开封市天济大药房。川乌打粉后与CMC-Na按1∶20的比例研磨,供体内实验使用。

1.2 试剂

DMEM培养液、胰酶(美国GIBCO公司);MTT (美国Sigma公司);DMSO(郑州派尼化学试剂厂);生理盐水;D-hanks缓冲液等。

1.3 动物与瘤株

昆明小鼠,雌性,22～25 g,河南省医学实验动物中心提供(合格证号:豫动合字101号);H22肝癌,本实验室昆明鼠腹水传代保存;小鼠Lewis肺癌细胞,本实验室传代培养提供。

1.4 仪器

HDL洁净台(北京东联哈尔仪器制造有限公司);快速混匀器SK-1(常州国华电器有限公司); El X800酶标仪(美国BIO-IEK公司);TDL-508台式离心机(上海安亭科学仪器厂);YN-ZD-2电热蒸馏水器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂);LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂);CHA-S恒温振荡器(常州国华电器有限公司); BD-400冰柜(河南冷柜厂);LGR16-W高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司);倒置生物显微镜(南京江南光电集团股份有限公司);电子天平(上海精密仪器有限公司)。

2 方法

2.1 对小鼠H22肝癌皮下移植肿瘤的影响

取生长良好的荷腹水型肝癌昆明小鼠处死,取腹水,加无菌生理盐水稀释成5×106个细胞/m L的稀释液。于状态良好的小鼠前肢右腋皮下接种。将接种后的小鼠按体质量随机分为模型组和川乌组,每组10只。模型组:灌胃蒸馏水0.2 m L/10 g;川乌组:灌胃川乌粉混悬液0.2 m L/10 g。方法均为每天2次,每次间隔8 h以上。肿瘤接种后即日开始给药,灌胃2周。治疗期间每隔一日监测小鼠体质量1次,待肿瘤长出后用游标卡尺每日测肿瘤长度和宽度1次,肿瘤大小按下列公式计算:肿瘤体积(mm3)=肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度/2。

全程治疗结束后,次日处死小鼠,剥离腋部肿瘤、肝脏、脾脏和胸腺,并称重,计算肿瘤抑制率及肝脏、胸腺、脾脏指数。

脏器指数(%)=内脏器官质量(mg)/处死当日体质量(g)×100%;肿瘤抑瘤率(%)= (1-T/C)×100%。

式中:C为模型组平均瘤质量(g);T为川乌组平均瘤质量(g)。

2.2 对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的影响

取小鼠Lewis肺癌传代细胞,加3 m L胰酶消化,振荡摇匀,37℃孵化2 min,加入2 m L培养基以中和胰酶,离心2次,弃去上清液,加入培养基吹打均匀,吹打成单细胞悬液,在细胞计数板上计数,调整细胞浓度至5×105个细胞/m L,备用。上述细胞点入96孔培养板,每孔100μL,另设置空白对照组及4个浓度梯度给药组(药物用培养基稀释),每组设置4个平行对照孔,分别加入空白培养基100μL,30倍稀释药物100μL,60倍稀释药物100μL,120倍稀释药物100μL,240倍稀释药物100μL,置于体积分数为5% CO2培养箱内,37℃条件下培养48 h,甩出板内溶液,加入5 g/L的MTT 100μL/孔,放置4 h,甩出96孔板中溶液,加入DMSO 100μL/孔,混匀,酶标仪于570 nm测OD值。

生长指数=给药组OD值/模型组OD值× 100%;抑制率=1-给药组OD值/模型组OD值× 100%。

2.3 统计学处理

3 结果

3.1 对H22肝癌荷瘤小鼠体质量、肿瘤及免疫器官的影响

与模型组小鼠相比较,川乌组瘤质量减小,胸腺、脾脏指数均增大,见表1、图1;对瘤体积的影响,见表2、图2;小鼠生长状态良好,P＞0.05,见图1。川乌对小鼠肝癌有一定的抑制作用,抑瘤率为32.05%。

表1 川乌对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤质量的影响(±s,n=10)

表1 川乌对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤质量的影响(±s,n=10)

组别 剂量/(m L/10 g) 瘤质量/g 胸腺指数/(mg/g) 脾脏指数/(mg/g) 抑瘤率/%模型组 - 3.37±0.87 2.15±1.38 65.15±10.39 -川乌组 0.2 2.29±0.30 3.01±0.90 57.95±2.81 32.05

图1 H22荷瘤小鼠生长曲线

表2 川乌对H22肝癌荷瘤小鼠瘤体积的影响(±s,n=10)

表2 川乌对H22肝癌荷瘤小鼠瘤体积的影响(±s,n=10)

组别 剂量/(m L/10 g) 瘤体积/mm3模型组 - 7 381.10±2 856.54川乌组 0.2 3 262.24±2 174.41

图2 瘤体积生长曲线

3.2 对小鼠脾细胞增殖以及对小鼠Lewis肺癌细胞增殖的影响

实验结果显示,随药物浓度的改变,抑制率也有所改变,药物浓度升高,则抑制率升高,见表3。

表3 川乌对小鼠Lewis肺癌细胞的抑制率

4 讨论

近代药理研究表明,川乌具有抗炎、麻醉镇痛、强心、降血压、降血糖、免疫调节、抗肿瘤等药理作用,化学成分是双酯型二萜类生物碱,包括乌头碱(Aconitine),次乌头碱(Hypaconitine),杰斯乌头碱(Jasaconitine),异翠雀碱(Isodelphinine)等。此类生物碱毒性很大,是乌头中的主要毒性成分[5]。本次实验的抑瘤率为32.05%,显示川乌对肿瘤的生长有一定的抑制作用。

此次实验MTT主要有两个用途:①药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;②细胞增殖及细胞活性测定。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。

川乌对免疫功能影响的研究结果目前尚不统一,有报道乌头中乌头碱对小鼠免疫器官和体液、细胞免疫均有不同程度的抑制作用[6]。

目前,在川乌的研究中还存在一些问题。首先,川乌的成分复杂,其毒性成分和有效成分的研究都集中在乌头碱,但川乌中乌头碱所占的比例很小;其次,川乌在体内的毒药物动力学过程以及与机体的交互作用研究困难;第三,川乌炮制减毒与配伍减毒的规范、标准等尚未完善,证治毒理学、配伍禁忌、妊娠禁忌等中药毒性理论基础研究不足。这些问题均须深入研究,为川乌在临床上的安全应用提供保障[7]。

综上所述,川乌有一定的抗肿瘤作用,但在肿瘤治疗应用中需注意剂量,最好与功能互补的中药联合应用。川乌对多种癌细胞均有直接杀伤效应和抑制作用[8],提示川乌在中西医结合治疗肿瘤方面有一定的应用前景。

[1]任正刚,杨秉辉.肝癌的化学药物治疗[J].中国处方药, 2005(5):34-36.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京:中国医药科技出版社,2010:36-37.

[3]白向阳.川乌的毒性与抗肿瘤作用概述[J].实用中医药杂志,2005,21(2):125.

[4]曾瑾,罗霞,江南,等.生川乌水煎液抗肿瘤作用的实验研究[J].四川大学学报:自然科学版,2007,44(6):1 344-1 348.

[5]钱信忠.有毒中药大辞典[M].天津:天津科技翻译出版公司,1992:64.

[6]王雅贤,贾亮,张德山,等.乌头碱对小鼠免疫功能影响的实验研究[J].中医药信息,1989,3(5):40.

[7]刘强强,郭海东,徐策,等.川乌毒理作用研究进展[J].中国中医药信息杂志,2012,19(8):110-112.

[8]Chao J C,Chu C C.Effects of Ginkgo biloba ex tract o ncell proliferation and cy totox icity in human hepatocellularcarcinoma cells[J].Wor1d J Gastroenterol,2004,10 (1):37.

[责任编辑 时 红]

Preliminary study of Radix Aconiti on anti-tumor

HUANG Xiuman1，2，LIU Yinghui2，DU Gangjun2*
（1.The first people's hospital of Nanyang Department of Clinical medicine，Nanyang，Henan 473000，China；2.Institute of Pharmacy，Pharmaceutical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China）

Objective To study the anti-tumor of Radix Aconiti preliminarily.Methods In vivo，the model of H22liver cancer was established to observe anti-tumor by measuring the volume，weight of in situ tumor and immune organs index after ig of Radix Aconiti medicinal liquor.In vitro，the effects of Radix Aconiti medicinal liquor on Lewis cells by MTT assay.Results In vivo，compared with the model group，the tumor in Radix Aconiti group was smaller，the tumor inhibitory rate was 32.05%，both of thymus index and spleen index increased.In vitro，Radix Aconiti medicinal liquor at used doses inhibited proliferation of lewis lung cancer cells.Conclusion Radix Aconiti medicinal liquor has beneficial effects on tumor treatment.

Radix Aconiti；H22；Lewis；MTT

R285.5

A

1672-7606(2014)02-0082-03

2013-09-30

国家自然科学基金项目(81173094);河南省高校青年骨干教师项目(2010GGJS-025);河南省科技厅重点攻关项目(112101310308);河南大学省部共建项目(SBGJ090704)。

黄秀曼(1988-),女,河南南阳人,硕士研究生,从事中药抗肿瘤药理学研究工作。

*通讯作者:杜钢军(1971-),男,博士,教授,从事中药抗肿瘤药理学的研究工作。