聚乙二醇/β谷甾醇双接枝壳聚糖共聚物纳米粒的体外释放与体内分布考察

凌 柏

(江苏省盐城市第一人民医院药剂科，江苏 盐城 224001)

近年来，纳米技术在医药领域得到了广泛的应用，以高分子材料包裹化学治疗药物制成载药纳米粒可以达到缓释、靶向给药的目的，减少药物的毒副作用[1]。如用脂质体包裹阿霉素，已在临床上得到了应用，但脂质体本身靶向分布不理想，且包封率低、稳定性差。因此，寻找更佳的载体材料是目前的一个研究热点。两亲性聚合物能在水性介质中通过自组装方式形成纳米粒子。该纳米粒具有独特的核壳结构，适合作为疏水性药物的载体;并且由于增强了渗透性和阻留效应，能在肿瘤病变部位富集，实现对肿瘤组织的“被动靶向性”，用作抗肿瘤药物的载体时能增加药物疗效，降低药物毒副作用。壳聚糖[2]是目前已知的天然多糖中唯一的碱性多糖，具有无毒性、无刺激性、无免疫原性、可降解性及优良的生物相容性，同时由于它含有某些有助于细胞黏附和保持细胞分化功能的信息，因此，壳聚糖及其衍生物已广泛应用于纳米给药载体[3－11]。本研究中以β谷甾醇为疏水组分、聚乙二醇(PEG)为亲水组分接枝至壳聚糖，制备了一种新型壳聚糖衍生物——PEG/β谷甾醇双接枝壳聚糖(PSC)，在水中PSC可自组装形成以β谷甾醇为疏水核心、PEG为亲水外壳的核－壳结构的纳米粒。PEG是亲水柔性大分子，在纳米粒外层形成的亲水层可减弱血浆蛋白的吸附，减少肝、脾中巨噬细胞的吞噬，使纳米粒在血液中具有“长循环”能力，而“长循环”能力是实现主动靶向的前提。β谷甾醇是人体需要的物质，具有很好的安全性和生物相容性，同时还可抑制胆固醇的吸收，维持胆固醇水平，降低动脉粥样硬化的可能性。本研究中主要对PSC纳米粒的自组装性能及体内组织分布进行了初步的探索与评价。

1 仪器与试药

F－4600型荧光分光光度计(日本Olympus公司);DF－Z型集热力磁力加热搅拌器，KQ－ZOOKD型高频率数控超声清洗器(昆山超声仪有限公司);SHZ－82型旋转气浴恒温振荡器(上海比朗仪器有限公司);SCMO旋转蒸发仪(上海中生科技有限公司);冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);85－1型恒温磁力搅拌器(常州国华仪器有限公司);MIKRO－200R型高速冷冻离心机(德国Hettich);XW－80A型微型旋涡混合仪(上海泸西分析仪器厂有限公司)。

PSC(实验室自制);聚乙二醇1000(PEG1K，西陇化工股份有限公司，CP，批号为120315);聚乙二醇2000(PEG2K，西陇化工股份有限公司，CP，批号为120730);香豆素－6，罗丹明B(上海紫一试剂厂，AR，批号为 20130225);丁二酸酐(CP，≥99.0%，批号为 T20100412);β 谷甾醇(＞75.0% ，批号为 A1203123);叶酸，四氢呋喃(THF，≥99.0%，批号为 T20111028);N，N－二甲基甲酰胺(DMF，批号为 T201110511);草酰氯(阿拉丁，CP，≥98.0%，批号为T200880325);氢化钙(阿拉丁，AR，批号为C1201027);甲烷磺酸(阿拉丁，99.0%，批号为39004);乙酸乙酯，甲醇，无水乙醇等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 PSC及其纳米粒制备

PSC:将PEG1K及PEG2K溶于二氯甲烷，加入丁二酸酐及DMF，加热回流12 h;旋转蒸干后，加入乙酸乙酯重结晶2次，沉淀析出时抽滤，滤饼晾干得羧化PEG;将羧化PEG溶于二氯甲烷，加入草酰氯，回流反应12 h，旋转蒸干得PEG酰氯。将β谷甾醇溶于二氯甲烷，加入丁二酸酐及DMF，加热回流12 h。旋干，加入蒸馏水搅拌，抽滤，滤饼干燥得羧化β谷甾醇;将羧化β谷甾醇溶于二氯甲烷，加入草酰氯，回流反应12 h，旋干，即得β谷甾醇酰氯。将壳聚糖溶于甲烷磺酸，先后加入β谷甾醇酰氯与PEG酰氯，50℃搅拌2 h，冰浴下加入适量蒸馏水终止反应，混合液转入透析袋(截留相对分子质量3 500)透析至中性，抽滤，滤液冻干，即得PSC。

空白和载香豆素－6的PSC纳米粒:取适量PSC样品，分散于水中，室温搅拌2 h，冰浴下以脉冲式超声仪超声20 min(输出功率100 W，工作2 s，间歇2 s)，即得空白PSC纳米粒悬液。取适量PSC与香豆素－6，溶解于乙醇中，搅拌30 min，装入透析袋(截留相对分子质量3 500)透析12 h，即得载香豆素－6的PSC纳米粒悬液。

2.2 临界聚集浓度(CAC)测定

采用稳态荧光探针法，考察PSC纳米粒在水溶液中的CAC。将PSC分散于水中，超声溶解，稀释至不同质量浓度(1.0×10－3～1.0 ×10－1g/L)，备用。精密量取 50 μL 芘的甲醇溶液(6.0 ×10－4mol/L)，置5 mL容量瓶中，氮气吹干。精密量取5 mL不同浓度的纳米粒悬液，分别加至吹干的容量瓶中，超声1 h。激发波长λex=337 nm，激发波长狭缝宽度5 nm，发射波长狭缝宽度10 nm，以荧光分光光度计记录各样品的发射光谱。以样品在发射波长为384 nm和373 nm波长处荧光强度的比值 I384/I373对样品质量浓度 C(g/L)的对数值logC作图，计算PSC纳米粒的CAC值。结果见图1。芘是一种脂溶性荧光探针，在极性环境中的荧光极弱，而在非极性环境中的荧光很强，故当水中有纳米粒或疏水结构域生成时，芘分子自发由水相向疏水结构域转移，其荧光强度显著增加。由图 1 可见，在低质量浓度时，PSCI384/I373值为 1.9～2.2，与芘在水中的比值接近，且变化不大;当质量浓度逐渐增大时，I384/I373突然降低，变化的转折点所对应的质量浓度为PSC的CAC。计算得PSC的CAC值为0.02 g/L，低于许多两亲性小分子物质的临界胶束浓度。

2.3 载药量与包封率测定

图1 芘发射光谱 I384/I373与PSC质量浓度的关系

精密称取一定量的PSC与香豆素－6(质量为 M0)，溶解于乙醇中，搅拌30 min，装入透析袋(截留相对分子质量3 500)透析12 h，将得到的载香豆素－6的PSC纳米粒悬液用0.45 μm微孔滤膜过滤，精密测定滤液体积 V。取0.5 mL滤液，与4.5 mL甲醇混匀，超声5 min，12 000 r/min，离心10 min，上清液用荧光分光光度计测定香豆素－6的荧光强度，根据标准曲线得到香豆素－6浓度 C。另取1 mL滤液，冷冻干燥后精密称定质量 M。计算载药量(loading capacity，LC)和包封率(encapsulation efficiency，EE)，LC(%，w/w)=[(C×V×10)/(M×V)]×100%，EE(%，w/w)=[(C×V×10)/M0]×100%。结果PSC纳米粒对香豆素－6的包封率为75%，载药量为3.3%，表明透析法可有效将香豆素－6载入纳米粒内核。

2.4 PSC纳米粒体外释放行为考察

以疏水性荧光物质香豆素－6为模型药物，采用透析法制备载香豆素－6的PSC纳米粒，以pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)为释放介质，考察其体外释放行为。

标准曲线绘制:将香豆素－6稀释成质量浓度分别为0.024 4，0.012 2，0.006 1，0.004 1，0.003 1，0.001 5，0.001 2 μg/mL 的甲醇溶液，采用荧光分光光度计(λex=446 nm，λem=510 nm，λex和λem的狭缝宽度均为10 nm)测定不同质量浓度香豆素－6溶液的荧光强度，绘制标准曲线，线性回归方程为 Y=169 991 X+7.26，R2=0.999 7(n=7)。结果表明，香豆素 －6 质量浓度在0.001 2～0.024 4 μg/mL范围内与荧光强度呈良好线性关系。

方法专属性考察:在相同条件下(λex=446 nm，λem=510 nm，λex和λem的狭缝宽度均为10 nm)，用荧光分光光度计检测空白PSC纳米粒溶液与释放介质，考察对香豆素－6的测定是否有干扰。结果在相同荧光光度计测定条件下，PSC空白纳米粒及释放介质PBS对香豆素－6的测定无干扰。

释放度测定与释放曲线绘制:采用透析法漏槽条件考察载药胶束的体外释放情况。将载香豆素－6的PSC纳米粒溶液装入透析袋(截留相对分子质量3 500)，再浸入装有PBS(pH=7.4)100 mL的烧杯中，置恒温振荡器中，37℃，100 r/min振摇。分别于 15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h，24 h 时将释放介质全部取出，更换新鲜的PBS 100 mL;同时，从取出的100 mL释放介质中精密吸取10 mL，用乙酸乙酯萃取3次，合并3次的有机层，旋转蒸发器挥干溶剂，残渣用5 mL甲醇溶解后用荧光分光光度计检测。根据标准曲线计算出每个时间点的释放量，得累积释放量及累积释放率，以时间为横坐标、累积释放率为纵坐标作香豆素－6的释放曲线图，见图2。可见，载香豆素－6的PSC纳米粒在30 min累积释放率约为23%，4 h约为56%，8 h约为68%，24 h约为98%，呈现出先突释后缓释的特点，具有一定的缓释能力。

2.5 载药PSC纳米粒组织分布考察

图2 载香豆素－6的PSC纳米粒释放曲线图(n=3)

药品准备:将100 mg PSC1K溶于2.5 mL乙醇中，并加入5 mg香豆素，搅拌30 min，装入10 cm的透析袋中(截留相对分子质量3 500)，透析12 h，过滤，冷冻干燥，取干燥品配成质量浓度为5 g/L的溶液。载药PSC2K纳米粒的处理方法相同。

给药设计及样本制作:取昆明小鼠18只(雌性，平均体重为18 g)，随机分为6组，每组3只。前3组小鼠尾静脉注射载药PSC1K纳米粒溶液0.3 mL，后3组小鼠尾静脉注射载药PSC2K纳米粒溶液0.3 mL。于给药后1，4，8 h摘眼球取血，置以1%肝素抗凝的EP管中。随即颈椎脱臼处死小鼠，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、脑，生理盐水洗去残余血液，去除多余结缔组织，滤纸吸干，称重后装入EP管。所有样品均置冰箱内保存，备用。

样本处理与检测:取各组织样品0.1 g(不足0.1 g的按实际质量)，加0.7 mL生理盐水匀浆;匀浆液中加入2.8 mL甲醇，涡旋5 min，14 000 r/min离心 10 min;取上清0.2 mL用甲醇稀释10倍后荧光分光光度计检测。

标准曲线绘制:配置质量浓度为 0.001～0.03 μg/mL 的香豆素甲醇溶液，用荧光分光光度计测定不同溶液的荧光强度。以香豆素甲醇溶液质量浓度对荧光强度进行线性回归分析，绘制标准曲线。香豆素线性回归方程为 Y=299 680X+94.672，R2=0.999 4。

组织分布:PSC1K溶液和PSC2K溶液经小鼠尾静脉注射后，以不同时间各组织中香豆素－6的含量来评价制剂在小鼠体内的组织分布。结果见图3。可见，PSC1K纳米粒尾静脉注射后，在各个组织的分布量于1 h达峰值，之后随着时间的延长药物分布量呈下降趋势。给药1 h时，各组织中肺的药物分布量最高，其次是肝、脾;PSC2K纳米粒尾静脉注射后，在各组织的分布量在1 h达峰值，之后随时间的延长药物分布量呈下降趋势。给药1 h时，各组织中心的药物分布量最高，而在2 h时心的药物分布量迅速降低。

图3 纳米粒小鼠体内的组织分布直方图

3 讨论

由图1可见，本试验中合成的PSC具有较小的CAC值，说明PSC纳米粒具有较强的势力学稳定性。用药时，即使被血液稀释到很低的浓度，依然能保持纳米粒结构，避免了药物的泄漏，保障了用药安全。

PSC1K溶液和PSC2K溶液经小鼠尾静脉注射，以不同时间各组织中香豆素－6的含量来评价制剂在小鼠体内的组织分布，了解载药PSC1K纳米粒及载药PSC2K纳米粒小鼠体内的组织分布情况(图3)。本试验发现，PSC1K纳米粒尾静脉注射后，在各个组织的分布量在1 h达峰值，之后随着时间的延长呈下降趋势;给药1 h时，各组织中肺的药物分布量最高，其次是肝、脾。这可能是由于PSC纳米粒带正电，与肺黏膜表面的负电荷基团相互作用，导致肺中药物分布量较高。肝、脾作为单核细胞吞噬系统的主要器官，对注射入体内的微小粒子具有吞噬作用，因此这两个组织中药物分布量也较高。肾与心的药物分布量很低，表明PSC纳米粒给药不会造成肾毒性和心脏毒性。与此同时，PSC2K纳米粒尾静脉注射后，与PSC1K相似，在各个组织的分布量在1 h达峰值，之后随着时间的延长呈下降趋势;给药1 h时，各组织中心的药物分布量最高，而在2 h时心脏的药物分布量迅速降低，这可能是由于残留在心脏的血液未被清洗干净，而血中的药物分布量较高所致。PSC2K在肺、肝、脾中的分布量较高，但与PSC1K相比，其被肝、脾摄取的量下降，这可能是因为PSC2K修饰了更长的PEG链，对避免被单核细胞吞噬系统吞噬具有更强的保护作用。值得注意的是，PSC2K与PSC1K相比，在脑部的药物分布量显著提高，一方面可能是由于PSC2K的循环时间更长，另一方面可能相对分子质量为2 000的PEG更容易与血脑屏障的细胞膜融合而使纳米粒跨血脑屏障。

总之，本试验成功地考察了新型两亲性壳聚糖衍生物PSC在水中自组装形成纳米粒的性能及组织分布。PSC作为一种新型的载药胶束，在水中可自组装成纳米粒;临界聚集浓度为0.02 g/L，具有较强的稳定性;载药量为3.3%，包封率为75%，能够有效包载香豆素，显著增加其溶解度。载香豆素－6的PSC纳米粒在30 min累积释放率约为23%，4 h约为56%，8 h约为68%，24 h累积释放率约为98%，表现为先突释后缓释的特点，具有一定的缓释能力。载药PSC纳米粒在肺部浓度较高，可能由于其荷正电与负电性的肺黏膜相互作用造成;由于巨噬细胞的吞噬在肝、脾中浓度也较高，修饰较长链的PEG可减少被肝、脾的吞噬;同时，修饰较长链PEG的纳米粒比修饰短链PEG的纳米粒在脑部的分布有所增加;两种PSC纳米粒在肾、心中分布均较少。上述结果表明，PSC胶束作为疏水性的抗癌药物载体，具有良好的发展前景。

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