藏茵陈总萜酮致突变性及抗突变性研究*

王 冲，侯 娟，韩 晶，芮 菁

(天津市药品检验所，天津300070)

藏茵陈总萜酮致突变性及抗突变性研究*

王 冲，侯 娟，韩 晶，芮 菁

(天津市药品检验所，天津300070)

目的:研究藏茵陈总萜酮在不同剂量下的致突变及抗突变作用。方法:Ames实验采用预培养法，微核实验采用连续灌胃给药10 d的小鼠骨髓嗜多染红细胞微核计数法。结果:致突变实验中，藏茵陈总萜酮在＜2 500 μg/皿和＜40 mg/kg剂量下，未诱发Ames实验各菌株回变菌落数和微核实验骨髓嗜多染红细胞微核率的增高。抗突变实验中，藏茵陈总萜酮在625～2 500 μg/皿浓度范围内，可使阳性剂环磷酰胺和丝裂霉素C所诱发的高回变菌落数出现明显降低;藏茵陈总萜酮在50～100 mg/kg剂量范围，可使阳性剂40 mg/kg环磷酰胺或2 mg/kg丝裂霉素C所诱发的高微核率出现明显降低。结论:本实验条件下，藏茵陈总萜酮不存在基因突变和染色体畸变作用，且有显著的抗突变作用。

藏茵陈总萜酮，致突变，抗突变

藏茵陈又名“蒂达”，系中华民族药中瑰宝，青藏高原藏药八珍之一，用于治疗热症、肝胆病与血液病，疗效显著，药用价值高［1］;另一方面，其植株生长周期短，有效成分含量高，来源丰富，具有可观的经济价值［2］。近年来，伴随着民族医药的迅猛发展，国内外已开发出很多以藏茵陈为主要原料的治疗药物和保健用品，用于某些疾病的防治和保健［3］。现代分析表明，藏茵陈中主要活性成分为环烯醚萜、呫吨酮、三萜等化学成分［4］。本研究对藏茵陈总萜酮进行了Ames实验及小鼠骨髓微核实验，以了解受试物是否具有体内、体外的致突变性和抗突变性，为藏茵陈的安全应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物藏茵陈总萜酮(TTKS)，黄色粉末状，为龙胆科獐牙菜属川西獐牙菜Swertia mussotii Franch提取物，天津药物研究院田成旺研究员惠赠，经高效液相色谱法检测其中獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、龙胆苦苷、芒果苷和当归醇苷的总质量分数为87.5%［5］。受试物以二甲基亚砜溶解为200 mg/ml，实验时以生理盐水稀释至相应浓度。

1.1.2 实验动物SPF级KM小鼠，军科院卫生环境医学研究所实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(军)2009－0003，实验动物使用许可证号SYXK(津)2011－0007。小鼠维持饲料，北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号SCXK(京)2009－0012。动物饲养室温度20～25℃，相对湿度40%～70%。人工照明，12 h明/12 h暗。实验动物于环境中适应3 d后用于实验。

1.1.3 菌株与试剂组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100和TA102菌株及大鼠肝微粒酶(S9)，购自上海宝录生物科技有限公司，MOLTOX公司产品，菌株经特性鉴定合格后使用;S9mix用Cofactor－I，购自オリエンタル酵母工业株式会社。阳性对照物9－氨基吖啶(9－AA)、呋喃基糠酰胺(AF－2)、2－氨基芴(2－AAn)、环磷酰胺(CP)及丝裂霉素C(MMC)，Sigma公司产品。氯化钠、氯化钾、琼脂等均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 致突变实验

1.2.1.1 Ames实验［6］采用平板掺入法，用TA100菌株的非代谢活化系统进行预实验，分别设受试物5 000、2 500、1 250、625、312、156、78和39 μg/皿8个剂量组，每个剂量2个平行皿，37℃下培养48 h后，镜下观察平皿中细菌背景菌苔的多少或有无。结果在剂量2 500 μg/皿时，未出现明显的抑菌现象，故正式实验最高剂量采用2500 μg/皿。正式实验:选取TA97、TA98、TA100和TA102菌株，采用平板掺入法。受试物设5个剂量组，分别为2 500、1 250、625、312和156 μg/皿;同时设空白对照组，给予生理盐水;溶剂对照组给予二甲基亚砜;阳性对照组分别给予9－AA，AF－2，MMC及2－AAn。每个测试浓度设3个平行皿，在活化(+ S9)与非活化(－S9)条件下，37℃培养48 h进行实验。计数每皿的回变菌落数，计算各组平均值和标准差及各剂量组平均回变菌落数与自发回变菌落数的比值(mutation ratio，MR)。若MR＞2，且呈剂量－反应关系者为阳性结果。重复实验1次。

1.2.1.2 微核实验选取KM小鼠50只，雌雄各半，体重为22～24 g，随机分为5组，每组10只。设受试物100、50和25 mg/kg 3个剂量组，及环磷酰胺阳性对照组和溶剂对照组。小鼠按20 ml/kg灌胃，溶剂对照及各受试物组连续灌胃10 d，溶剂对照组给予等剂量生理盐水，末次给予受试物后6 h，小鼠脱臼处死;阳性对照组一次性腹腔给予环磷酰胺40 mg/kg，24 h后处死动物。取股骨骨髓常规制片，甲醇固定，Giemsa染色。镜检嗜多染红细胞(PCE)，每只动物计数1 000个，计算含微核的细胞数(MN)及微核细胞千分率，同时计数200个嗜多染红细胞，计算嗜多染红细胞与正红细胞的比值(PCE/NCE)。

微核率(‰)=(含有微核的细胞数/嗜多染红细胞数)×1 000‰。

1.2.2 抗突变实验［7］

1.2.2.1 Ames实验选用TA100和TA102两个菌株。将菌株、±S9混合液和阳性剂(CP或MMC)三者均匀混合后，于37℃振荡水浴培养箱中，预培养30 min后，再加入不同浓度的受试物及顶层培养基，混合均匀后倒碟，其他实验方法同致突变实验。

1.2.2.2 微核实验选取KM小鼠90只，雌雄各半，体重为22～24 g，随机均分为9组，其中受试物高、中、低剂量各2组(给予不同阳性药)，溶剂对照组及阳性对照组。溶剂对照及受试物各剂量组连续灌胃给予10 d，溶剂对照组给予等剂量的生理盐水。于动物处死前24 h，除溶剂对照组外，各组均一次性腹腔注射给予致突变剂40 mg/kg CP或2 mg/kg MMC，末次给予受试物6 h后处死小鼠。常规取股骨骨髓，小牛血清稀释后涂片，干燥，甲醇固定，Giemsa染色，每只小鼠于油镜下计数1 000个PCE中出现的MN。

1.2.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，骨髓微核率采用χ2检验。

2 结果

2.1 致突变实验

2.1.1 Ames实验藏茵陈总萜酮各剂量组对鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100及TA102诱发的回变菌落数见表1。在加与不加S9的条件下，各菌株阳性对照组MR均大于2;而藏茵陈总萜酮各组的MR均小于2，与自发回变数相比，未见明显增加，表明藏茵陈对鼠伤寒沙门氏菌无致突变作用。

2.1.2 微核实验藏茵陈总萜酮各剂量组对小鼠骨髓细胞微核率的影响见表2。结果显示:阳性对照组微核细胞率为30.4‰，与溶剂对照组比较，具有极显著性差异(P＜0.01)。藏茵陈总萜酮各剂量组微核细胞率均小于3‰，与溶剂对照组比较，差异无显著性(P＞0.05)。

2.2 抗突变实验

2.2.1 Ames实验藏茵陈总萜酮各剂量组对鼠伤寒沙门氏菌TA100及TA102诱发的回变菌落数见表3。两种菌株于不同的致突变剂［烷化剂－环磷酰胺(需代谢活化)，丝裂霉素(不需代谢活化)］作用下，可致菌株回变菌落数显著增加，MR均大于2。藏茵陈总萜酮于625～2 500 μg/皿范围内，可降低两种菌株回变菌落数，与相应的阳性对照组比较，均有显著性差异。表明藏茵陈总萜酮对阳性诱变剂所诱导的Ames试验菌株的回复突变具有拮抗作用。重复实验一次(数据未显示)，两次实验结果一致。

2.2.2 微核实验阳性组和各剂量加阳性试剂处理组所诱发的微核细胞率见表4。结果显示:MMC、CP组的微核细胞率均有显著升高，分别为33.5‰及28.9‰。动物连续灌胃给予受试物3个剂量10 d，微核细胞率有明显降低，并且伴随着藏茵陈总萜酮剂量的增加而减少。藏茵陈总萜酮50、100 mg/kg剂量组与阳性对照组比较，有显著性差异。

表1 藏茵陈总萜酮Ames实验结果(s)

表1 藏茵陈总萜酮Ames实验结果(s)

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表2 藏茵陈总萜酮微核实验结果(s)

表2 藏茵陈总萜酮微核实验结果(s)

与阴性对照组比较，＊＊P＜0.01

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表3 藏茵陈总萜酮的Ames实验抗突变结果(

表3 藏茵陈总萜酮的Ames实验抗突变结果(

与阳性对照组相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01阳性药物:TA100:CP 200 μg/皿;TA102:MMC 2 μg/皿

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表4 藏茵陈总萜酮的微核试验抗突变结果(s)

表4 藏茵陈总萜酮的微核试验抗突变结果(s)

与阳性对照组相比，*P＜0.05;＊＊P＜0.01

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3 讨论

藏茵陈总萜酮为川西獐牙菜提取物，由环烯醚萜类、呫吨酮类、三萜类等多种成分构成，具有广泛的生物活性。环烯醚萜类主要包括獐牙菜苦苷、獐芽菜苷、龙胆苦苷等，具有抗炎、抗胆碱、修复肝损伤细胞、保护胃溃疡、抗癌等药理活性［8，9］;呫吨酮类包括芒果苷、当药醇苷、1－三羟基－3，3，4－三甲氧基呫吨酮等，具有抑制转氨酶升高、抗乙肝病毒等广泛的药理活性［10］。相对于藏茵陈功效学的研究，其毒理方面的研究却鲜有报道［11］。通过本实验表明，藏茵陈主要活性成分——总萜酮在＜2 500 μg/皿和＜40 mg/kg剂量下，Ames实验和微核实验结果均为阴性，根据WHO的标准判定，可认定该受试物为非遗传毒物。

为进一步检测藏茵陈总萜酮是否具有抗突变的特性，本实验参考已有的文献方法［7，12］，根据药物抗突变的一般机理，设计了不同目的的抗突变性实验。其中，Ames实验设计以考查受试物是否具有促进已突变细胞的DNA修复，减少DNA损伤数量为目的;小鼠微核实验设计以考查受试物是否具有保护未突变细胞免受损伤或减少细胞DNA损伤数量为目的。结果表明，藏茵陈既有促进已突变细胞DNA修复的细胞内抗突变作用，又可保护未突变细胞免受损伤，对致突变物有一定的灭活作用。

综上所述，在本实验条件下，藏茵陈总萜酮未引起Ames实验菌株回复突变数及小鼠骨髓微核率增加，提示藏茵陈总萜酮无致突变性。另一方面，藏茵陈总萜酮可拮抗由CP及MMC引起的突变作用，提示藏茵陈总萜酮具有抗突变性。

1唐丽，马瑛，蔡晨秋，等.大孔吸附树脂法富集纯化藏茵陈总黄酮［J］.中医药学报，2011，39(1):51

2刘莹，田成旺，张铁军.藏茵陈的药理与临床研究进展［J］.现代药物与临床，2012，25(5):345

3汪海英.八味獐牙菜散加减治疗慢性胆囊炎80例［J］.浙江中医杂志，2009，44(7):537

4马丽娜，张铁军，田成旺，等.大孔树脂分离纯化川西獐牙菜中环烯醚萜苷类和口山酮类成分的工艺研究［J］.中草药，2010，41(2):227

5李爽，田成旺，吴帅，等.藏茵陈总萜酮的人肠内细菌代谢研究［J］.中国中药杂志，2012，37(24):3743

6刘臻，梅松，刘冬英，等.马尾松松针粉袋泡茶水提物的急性毒性和致突变性研究［J］.癌变·畸变·突变，2012，24(5):383

7林飞，郭芳，李铭，等.北豆根多糖的致突变性与抗突变性研究［J］.实用肿瘤学杂志，2007，21(3):208

8乔伟，张彦文，吴寿金，等.天然环烯醚萜类化合物的生物活性［J］.国外医药·植物药分册，2001，16(2):65

9周源，刘英姿，李锋，等.獐芽菜苦苷对乙醇致小鼠胃溃疡的保护作用［J］.中国新药杂志，2008，17(20):1768

10Li J C，Feng L，Sun B H，et al.Hepatoprotective activity of the constituents in Swertia pseudochinensis［J］.Biol Pharm Bull，2005，28: 534

11黄仁勇.口服藏茵陈片出现男子性功能障碍1例［J］.药物流行病学杂志，2000，9(1):45

12王明臣，张善锋，毛丽红，等.Ames实验对叶黄素的致突变性及抗突变性研究［J］.癌变·畸变·突变，2006，18(1):65

Studies on the safety and anti－mutagenicity of total terpene ketones form Swertia mussotii

Wang Chong，Hou Juan，Han Jing，Rui Jing
(Tianjin Institute for Drug Control，Tianjin 300070)

Objective:To study the mutagenic and anti－mutagenic activity of total terpene ketones from Swertia mussotii (TTKS)under different doses.Methods:The studies were conducted with Ames test of preceding incubate and micronucleus test in mouse which was administrated gavage once a day for a consecutive 10 d.Results:In mutagenic test，TTKS at a dose lower than 2000 μg/plate induced neither remarkable nor dose－dependent increase mutagenicity of the four strains and at a dose lower than 100 mg/kg did not increase the micronucleus frequencies of polychromatic erythrocytes.In anti－mutagenic test，comparing with the positive groups of CP and MMC，TTKS at 625～2500 μg/plate could decrease the colony numbers in T100and T102strains; TTKS at 50～100 mg/kg could significantly reduced the rate of micronucleus frequencies polychromatic erythrocytes in bone marrow of mice induced by CP and MMC as compared with the positive control.Conclusion:Under our experimental conditions，TTKS has no effect of mutagenesis and processes significant anti－mutagenic properties.

total terpene ketones from Swertia mussotii，mutagenicity，anti－mutagenicity

R965

A

1006-5687(2014)01-0017-04

2013-10-09