一种基于光子计数技术的时间分辨荧光免疫分析系统设计

高 峰，李峰辉，李 娇，易 茜，陈 琛(. 天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 30007；. 天津市生物医学检测技术与仪器重点实验室，天津 30007)

一种基于光子计数技术的时间分辨荧光免疫分析系统设计

高 峰1,2，李峰辉1，李 娇1，易 茜1，陈 琛1
(1. 天津大学精密仪器与光电子工程学院，天津 300072；2. 天津市生物医学检测技术与仪器重点实验室，天津 300072)

以稀土荧光配合物作为标记物的时间分辨荧光免疫测定法在医学与生命科学的实践与研究中正发挥着越来越重要的作用．为此，设计了一种结构简单、成本低廉的基于FPGA的时间分辨光子计数器系统，改进了原有的Prony算法从而实现了对双组分五参数荧光信号的处理，并使用异氰酸苄基二乙烯三胺四乙酸络合铕(DTTA-Eu3+)和模拟的双组分荧光信号对系统和算法进行了实验验证．实验结果表明，系统对于DTTA-Eu3+的检测具有较高的准确度与线性度，相关系数r=0.996 2．对于双组分荧光信号，当两个荧光信号的差值在10倍以上时，使用改进后的Prony算法进行处理具有较高准确度，误差低于5%．

免疫；荧光寿命；时间分辨光子计数；Prony算法

时间分辨荧光免疫分析是用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替同位素、酶、荧光物质和化学发光物质，标记抗体、抗原、核酸探针等物质，当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱特点，测定免疫反应最后产物的寿命和荧光强度．根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的[1-3]．时间分辨荧光免疫分析技术已经在临床检测与生物技术领域得到了广泛的应用，其最大的优点就是可以消除各种短寿命散乱光和本底荧光对测定的影响，从而极大地提高测定灵敏度[4-6]．由于我国在这方面的研究起步较晚，很多测量仪器及试剂还要依靠进口，因此仪器与试剂的国产化产业化，必定会大大降低生产成本，带动国内相关产业的发展．

本文针对现有的时间分辨荧光免疫分析系统造价昂贵等问题设计了一种结构简单、成本低廉的基于FPGA的时间分辨光子计数器系统．该系统对于荧光信号检测具有较高准确度，可以对微弱信号进行检测．与传统的时间分辨荧光免疫分析系统不同的是：①该系统不仅可以检测最后产物的荧光强度，还可以检测荧光的寿命，对检测信号进行实时成像，具有较高的灵敏度；②该系统可以检测含有双组分荧光的信号，通过改进后的Prony算法[7-9]可以计算出两个组分荧光的寿命以及两个组分荧光强度的比值．

1 基于FPGA设计的时间分辨光子计数器系统

1.1 系统结构

时间分辨光子计数器系统包括光源部分、调制部分、探测部分、数据采集部分和数据处理部分．系统原理及实物如图1所示．

图1 系统原理及实物Fig.1 System schematics and actual system

根据时间分辨荧光免疫分析对于光源等的要求，选择了符合设计需求的元器件和设备，具体情况如下所述．

1.1.1 对于单组分荧光的检测

(1) 光源部分．目前常用的镧系元素为铕，它的激发光波长为340,nm，发射波长为613,nm．本文采用波长为365,nm的LED作为激发光源(M365F1，美国Thorlabs Inc)，由1个LED(M365F1，美国Thorlabs Inc)和1个调制器(LEDD1B，美国Thorlabs Inc)组成．调制器由调制电路控制，可以实现对LED的调制，以产生所需要的激发脉冲．

(2) 调制部分．本文采用的光源为LED，它不能直接对待测试剂进行激发，需要加载调制信号，调制部分主要是实现对光源部分的调制，激发脉冲的脉宽和光强可以通过调制电路进行设定．在对LED进行调制的同时，调制电路还会发送给时间分辨光子计数器一个同步的电信号，标志每个计数周期的开始．

(3) 探测部分．铕的发射波长为613,nm，为了将本底荧光以及激发光消除，本文采用了截止波长为400,nm的长通滤波片(FEL0400，美国Thorlabs Inc)．滤波片通过1个套筒与光电倍增管(H7155，日本HAMAMATSU Inc)相连．光电倍增管(PMT)是将探测到的荧光信号转化为电信号的装置，具有很高的灵敏度，可以对微弱信号进行检测．入射光纤和探测光纤采用的是芯径为500,μm的光纤，为了减少激发光对结果的影响，实际操作中使入射光纤的长度略长于探测光纤，并将两根光纤垂直地并在一起固定在升降架上．升降架用于实现光纤的升降等操作．成像腔用于容纳被测试剂，采用四周为黑色的成像腔，可以实现对激发光的吸收，防止激发光发生反射效应，影响实验结果．

(4)数据采集部分．荧光经过PMT后，转变为可以探测到的电信号，数据采集部分实现对信号的完整采集，包括1个时间分辨光子计数器和1个通信模块．时间分辨光子计数器的功能主要由FPGA来实现(CyloneⅢ EP3C25F324，美国ALTERA Inc)；通信模块实现时间分辨光子计数器与数据处理部分之间的通讯功能，包括将数据传回数据处理部分、接收数据处理部分的命令等，其核心由FT245BM芯片构成．

(5)数据处理部分．主要是实现对数据的处理以及对整个系统的控制等．具体包括1个计算机和系统软件(Labview/Matlab等)，数据处理部分可以对得到的数据进行实时处理，得到荧光信号曲线以及光强．

1.1.2 对于改进后的Prony算法的验证

为了验证改进后的Prony算法对含有基线漂移量的双组分荧光信号处理的准确度，本文采用模拟的荧光信号进行实验．与第1.1.1节不同的是光源部分与调制电路．考虑到铕的发射波长为613,nm，光源部分采用波长为675,nm的温控半导体激光器系统作为辐射光源，由温度-电流控制模块(LTC100-B，美国Thorlabs Inc)和激光尾纤(LPS-PM675-FC，美国Thorlabs Inc)组成，其后连接一个电控可变衰减器(FVA-3100，加拿大EXFO Inc)用于调节输出强度.由于该激光器是稳态激光器，因此需要外加调制信号对光源进行调制，调制电路此时产生的调制信号不是一个脉冲，而是一个按照指数衰减的波形．经过调制后的光经过1个透明仿体后被PMT接收，后面的处理与对单组分荧光的检测相同．

1.2 时间分辨光子计数器原理以及工作过程

时间分辨光子计数器用于光子计数时等价于一个数字示波器，或是一个瞬态记录仪[10]，它可以对待测信号进行实时成像，记录信号波形．本文设计的计数器含有2,048个通道，通道门宽可以自由设定．它主要由命令解释控制模块、通信控制模块、预累加器、通道切换信号产生模块CLK和SRAM读写模块构成．计数器内部的工作过程如图2所示．

图2 计数器工作过程示意Fig.2 Working diagram of the counter

在每个计数周期的开始，激发光源发出1个激发脉冲给待测试剂，同时激发光源发给时间分辨光子计数器1个同步电信号，标志1个计数周期的开始，滤光片可以滤过激发光、背景光等．在1个通道内，当时间分辨光子计数器接收到由光电倍增管(PMT)传过来的电信号以后，会在预累加器内进行计数操作，1个通道1个周期内可计多个光子．当接收到通道切换信号以后，开始切换通道，同时把预累加器内的数据存储到对应的存储器内，当前的存储器地址实现“加1”操作，并把预累加器置零．当2,048个通道切换完成后，该周期停止计数，地址复位，接收到下一个激发脉冲的同步信号时开始新的计数周期．当达到设定的计数周期后，时间分辨光子计数器会向计算机发送计数结束命令，计算机接收到命令后开始数据传输，把存储器内的数据传输给计算机．计算机对接收到的数据进行处理，得到荧光的寿命以及强度．

2 改进后的Prony算法

荧光是分子吸收能量后，其基态电子被激发到单线激发态后由第一单线激发态回到基态时发生的，而荧光寿命是分子在单线激发态平均停留的时间[11].对于单组分指数衰减的荧光寿命估计，常用的算法有对数拟合算法、Marquardt非线性最小方差近似算法和Prony方法．双组分指数衰减模型可以用Prony方法来解决．

对于不含基线漂移量的双组分荧光衰减信号，可直接用Prony算法进行计算．然而，实际信号都含有基线漂移量，这种情况下不能直接使用Prony算法进行计算．对于含有基线漂移量的两个组分的指数衰减信号，可表示为

式中：A1和A2分别为各个荧光信号的初始光强；τ1和τ2为各个分量的荧光寿命；B为基线漂移量．对式(1)进行求导可得

将测量时间划分成N个时间间隔为Δ的采样窗口，将式(1)化为

在时间xΔ到(x+1)Δ上对式(2)进行积分，得到H(x)，即

应用Prony算法最后可以得到

式中：α1和α2为引入的两个待定系数；ΔN为取样间隔，需要满足N-2ΔN≥2的条件．当求得α1和α2后，就可以得到uΔN和uΔN的表达式，即12τ1和τ2的估计值为

求出1τ和2τ后，可由数据拟合求得两个荧光信号的强度比值．

3 实验结果与分析

实验分为单组分荧光信号实验和双组分荧光信号实验两部分．

3.1 单组分荧光信号实验

单组分荧光信号采用的是DTTA-Eu3+(天津协和医药科技集团)．通道门宽设定为480,ns，计数周期为1,000个，每个周期时间为1,μs，总共计数时间为1,s．为了验证系统对于荧光信号检测的线性度，以母液作为起始浓度，进行不同比例的稀释，然后做出DTTA-Eu3+的标准曲线．

首先将一定浓度的DTTA-Eu3+试剂溶于10,mL的增强液中作为母液，取出1,mL母液放入9,mL的增强液中标记为，将光源的光强调至为固定值200,mA．取出3,mL的试剂放入成像腔中进行测量，测量完后检测探测到的光子数以及荧光寿命，检测结束后取出试剂1.5,mL再溶于1.5,mL的增强液中，标记为，将放入成像腔中进行测量并记录，以此类推进行测量．以DTTA-Eu3+的含量作为横坐标，以采集到的光子数为纵坐标做出Eu3+的测量曲线．检测荧光寿命采用数据拟合的方法，数据的采样窗口选定为800～1,800通道(384～864,μs)的时间宽度．实验结果如图3所示，图3(a)为采集到的信号波形，图3(b)为Eu3+的测量曲线．

通过数据拟合可得时间常数τ=0.720 2×10-3,s，相关系数r=0.996 2．由结果可以看出，时间分辨光子计数器对于长寿命的荧光信号具有较高的准确度，误差低于5%．

3.2 双组分荧光信号实验

采用模拟的荧光信号进行Prony算法的验证实验，即由调制电路对稳态激光器进行调制，以产生相应的模拟荧光信号，调制电路的调制信号由两个单稳态触发电路和一个加法器产生，两个信号相互独立，不受影响．为了验证改进后的Prony算法的应用范围，设计了两组实验，第1组两个调制信号的时间常数相差10倍左右，第2组两个调制信号的时间常数相差3倍左右．通道门宽设定为300,ns，计数周期为1,000个，每个周期时间为0.7,μs，总共计数时间为0.7,s．

图4(a)为第1组实验的调制信号波形1、调制信号波形2以及两个调制信号叠加后的合成信号；图4(b)为实际测量结果，3种曲线分别代表原始数据、滤波数据以及通过Prony算法得到两个时间常数后，进行数据拟合得到的曲线，为的是得到两个组分信号强度的比值．

图3 单组分实验结果Fig.3 Single-component experimental results

图4 时间常数相差10倍左右的双组分模拟信号实验结果Fig.4 Experimental result of a simulative bi-component singal with a time-constant contrast of about 10∶1

对于双组分的荧光信号采用改进后的Prony算法进行处理，采样窗口选定为200～1,000通道的时间宽度，Δ 取为300,ns．其中调制信号1的参数为：电阻R1=15.07,kΩ，电容C1=22,nF，可得时间常数τ1=R1,C1=0.331,5,ms；调制信号2的参数为：电阻R2=3.01,kΩ，电容C2=10,nF，可得时间常数τ2= R2,C2=0.030,1,ms，调制信号中A1/A2的值由两个调制信号的电压值决定，对实验结果使用Prony算法进行处理，其中A1/A2的值是得到两个时间常数后进行拟合得到的结果．表1为对比结果，由结果可以看出对于两个信号相差比较大的情况下(10倍以上)，改进后的Prony算法具有较高的准确度，误差低于5%．

表1 时间常数相差10倍左右的双组分模拟信号实验结果Tab.1 Experimental data of a simulative bi-component signal with a time-constant contrast of about 10∶1

第2组两个调制信号的时间常数相差3倍左右．图5(a)为第2组实验的调制信号波形1、调制信号波形2以及两个调制信号叠加后的合成信号，图5(b)为实际测量结果．

图5 时间常数相差3倍左右的双组分模拟信号实验结果Fig.5 Experimental results of a simulative bi-component signal with a time-constant contrast of about 3∶1

采样窗口选定为200～1,200通道的时间宽度，Δ取为300,ns．其中调制信号1的参数为：电阻R1= 8.69,kΩ，电容C1=22,nF，可得时间常数τ1=R1,C1= 0.191,2,ms；调制信号2的参数为：电阻R2= 7.03,kΩ，电容C2=10,nF，可得时间常数τ2=R2,C2= 0.070,3,ms，对实验结果使用Prony算法进行处理，表2为对比结果．由结果可以发现，当两个信号的时间常数相差不大(3倍以内)时，应用改进后的Prony算法对实验数据进行处理，结果不是很理想，误差在20%左右．

表2 时间常数相差3倍左右的双组分模拟信号实验结果Tab.2Experimental data of a simulative bi-component signal with a time-constant contrast of about 3∶1

4 结 语

基于FPGA所设计的时间分辨光子计数器系统对于长寿命荧光检测具有较高的线性度与准确度，它可以同时检测荧光的强度以及寿命，可以进行实时成像．整套系统成本较低，有利于应用推广．在对荧光信号的处理上，改进后的Prony算法解决了含有基线漂移量的双波长荧光信号测量的问题，当两个信号差值在10倍以上时具有较高的准确性，误差在5%以内；而当两个信号差值在3倍以内时，则具有较大误差．

通过实验可以看出，本系统尚需改进．首先是对于双波长荧光信号的处理上，当两个信号差值在3倍以内时，需要其他的算法进行处理．其次是可以采用自制的激发光系统替代现有的激光器，以降低成本．希望通过以上改进方式，可以得到更好的测量结果，使系统具有更广阔的发展前景．

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(责任编辑：赵艳静)

A Photon Counting Technology-Based Time-Resolved Fluorescence Immunoassay System Design

Gao Feng1,2，Li Fenghui1，Li Jiao1，Yi Xi1，Chen Chen1
(1. School of Precision Instrument and Opto-Electronics Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China；2. Tianjin Key Laboratory of Biomedical Detecting Techniques and Instruments，Tianjin 300072，China)

Time-resolved fluorescence immunoassay using rare earth fluorescent complexes as markers plays an increasingly important role in the study and practice of medical and life sciences. A FPGA-based time-resolved photon counter system is designed in this paper，which has the advantages of simple structure and low cost，and an improved Prony algorithm is also presented in order to obtain five parameters by processing two-component fluorescence signals. In the experiment，a fluorescent complex(europium-chelate of N-(p-isothiocyanatobenzyl)-diethylenetriamine-N，N，N，N-tetraacetic acid，DTTA-Eu3+)and simulated two-component fluorescence signals are used to validate the availability of the proposed method and system. The experimental results show that this system has reasonable accuracy and linearity with the correlation coefficient r=0.996 2 for the detection of DTTA-Eu3+，and that when the difference of two-component fluorescence signals is more than ten times，the improved Prony algorithm can achieve the relatively high accuracy，with the error of less than 5%.

immunity；fluorescence lifetime；time-resolved photon counting；Prony algorithm

Q63

A

0493-2137(2014)06-0518-06

10.11784/tdxbz201210021

2012-10-15；

2012-12-02.

国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2009AA02Z413)；国家自然科学基金资助项目(30970775)；天津市自然科学基金资助项目(09JCZDJC18200).

高 峰（1963— ），男，教授.

高 峰，gaofeng@tju.edu.cn.

时间：2013-11-07.

http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1127.N.20131107.1518.001.html.