HPLC法测定银杏叶缓释微丸胶囊中山奈素、异鼠李素、槲皮素的含量

江东波 马晓鹂* 李朝晖 蔡伟明 官堂明

(广东医学院附属医院药学部，广东 湛江 524001）

HPLC法测定银杏叶缓释微丸胶囊中山奈素、异鼠李素、槲皮素的含量

江东波 马晓鹂* 李朝晖 蔡伟明 官堂明

(广东医学院附属医院药学部，广东 湛江 524001）

目的建立以高效液相色谱法测定银杏叶缓释微丸胶囊中山奈素、异鼠李素、槲皮素含量的方法。方法以C18为色谱柱，流动相为甲醇-0.4%磷酸溶液（45∶55），检测波长为360 nm，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，进样量是10 μL。结果槲皮素在0.1505～0.9030 μg（r＝0.9999）浓度范围内有良好的线性关系，平均回收率为99.86%，RSD=0.4%；山奈素在0.1450～0.8940 μg（r＝0.9998）浓度范围内有良好的线性关系，平均回收率为99.79%，RSD=0.5%；异鼠李素在0.0995～0.5970 μg（r＝0.9998）浓度范围内有良好的线性关系，平均回收率为99.80%，RSD=0.3%。结论本方法简便、准确、专属性强，可用于该制剂的质量控制。

银杏叶缓释微丸胶囊；山奈素；异鼠李素；槲皮素；高效液相色谱法

银杏叶为银杏科植物银杏树的干燥叶，从银杏叶中分离出大量的极性和非极性化合物，主要包括黄酮（双黄酮6种，黄酮苷元7种，黄酮苷17种，桂皮酰衍生物5种）、萜类（银杏内酯A，B，C，J及白果内酯）、烷基酚和烷基酚酸类化合物[1]。性味甘苦涩平，功效为益心敛肺、化湿止泻、主治胸闷心痛、心悸怔忡、痰喘咳嗽、泻痢、白带。银杏叶提取物在临床上主要应用于治疗冠心病、心绞痛、高血压、高血脂症及脑出血痉挛等症，防治中风、心肌梗死、老年脑血管病、痴呆、大脑脑外伤后遗症、大脑紊乱等[2]。目前开发的银杏叶制剂有片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、口服液、滴剂、软膏、气雾剂、霜剂等多种剂型，也有银杏叶缓释片和缓释胶囊。国内生产的银杏叶制剂多为普通片剂和胶囊等，存在服用次数多、生物利用度低等问题，因此有必要进一步研制开发缓释制剂，满足预防和治疗心脑血管疾病的用药需要。本项目制备了银杏叶缓释微丸，为更好地控制本品质量，本文采用HPLC法同时测定其中山奈素、异鼠李素、槲皮素的含量以便考察总黄酮醇苷的含量，报道如下。

1 仪器与试药

Waters2695-2996型高效液相色谱仪（美国Waters公司）。山奈素、异鼠李素、槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，含量测定用，批号：110861-200808、110860-200608、100081-200406）；银杏叶缓释微丸胶囊（自制，规格：含总黄酮醇苷2 mg/g，批号：100501、100502、100503）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国迪马公司）；磷酸等其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：KromasilC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.4%的磷酸溶液=45∶55；流速：1 mL/min；检测波长：360 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。在此条件下，供试品中山奈素、异鼠李素、槲皮素峰能达到基线分离，理论板数按槲皮素峰计应不低于2500，色谱图见图1～3。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，得到槲皮素、山奈素、异鼠李素混合对照品贮备液，再精密量取20 mL对照品贮备液置200 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度得到槲皮素、山奈素、异鼠李素的浓度分别是30.1、29.8、19.9 μg/mL的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取银杏叶缓释微丸胶囊10粒，研细，精密称取适量（约相当于银杏叶提取物80 mg），置20 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。

2.4 空白供试液的制备

取处方比例辅料，按银杏叶缓释微丸胶囊制备工艺制得空白胶囊，再按“2.3”项下制备方法制得空白供试品溶液。

2.5 辅料干扰试验

取上述3种溶液，照“2.1”项下色谱条件，分别注入液相色谱仪，结果表明供试品色谱在与对照品色谱相应保留时间位置上，有三个相同的色谱峰，而空白供试液在此保留时间内不出峰，表明此法专属性强。

2.6 线性关系考察

精密吸取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品溶液5、10、15、20、25、30 μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定三者色谱峰面积，以三者的进样量（X）为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：槲皮素：y=-15701.9+493445.2x(r=0.9999)，线性范围是：0.1505～0.9030 μg；山奈素：y=-8701.7+464524.1x(r=0.9998)，线性范围是：0.1450～0.8940 μg；异鼠李素：y=-9341.3+405512.8x(r=0.9998)，线性范围是：0.0995～0.5970 μg。

图1 标准品高效液相色谱图（1：异鼠李素；2：山奈素；3：槲皮素）

图2 银杏叶微丸胶囊样品高效液相色谱图

图3 空白样品高效液相色谱图

表1 槲皮素回收率试验结果

表2 山奈素回收率试验结果

表3 异鼠李素回收率试验结果

2.7 重复性试验

取同一批供试品（批号100501）6份，按“2.3”项下的方法制备6份供试品溶液，并按照“2.1”项下色谱条件测定。结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别是＝1.1%、0.9%、1.0%，表明此法重复性好。

2.8 稳定性试验

取上述供试品溶液20 μL，分别在0、1、2、4、8 h进样测定，槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别是＝0.8%、0.9%、0.7%（n=5），表明供试品溶液在8 h内测定基本稳定。

2.9 进样精密度试验

取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品溶液连续进样6次，按“2.1”项下方法测定槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别是＝0.7%、0.7%、1.0%，表明此法的进样精密度良好。

2.10 加样回收试验

精密称定银杏叶缓释微丸胶囊（批号：100503，含槲皮素0.75 mg/g、山奈素0.69 mg/g、异鼠李素0.32 mg/g）粉末适量（相当于银杏叶提取物40 mg），分别置20 mL量瓶中。再精密量取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品溶液5 mL分别加至上述20 mL量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件，测定槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积，计算其测得量，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的平均回收率分别是99.86%、99.79%、99.80%，RSD分别是＝0.4%、0.5%、0.3%。见表1～3。

2.11 样品测定

取银杏叶缓释微丸胶囊，研细，精密称取适量（约相当于银杏叶提取物80 mg），置20 mL棕色容量瓶中，加甲醇适量，超声使溶解并定容至刻度，摇匀，滤过，按“2.1”项下色谱条件测定槲皮素、山奈素、异鼠李素峰面积，计算银杏叶缓释微丸胶囊中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量，按公式：总黄酮醇苷含量=（槲皮素的含量+山奈素的含量+异鼠李素的含量）×2.51，计算总黄酮醇苷的含量，3批样品测定结果表明银杏叶缓释微丸胶囊中总黄酮醇苷的平均含量是标示量的99.5%，RSD是0.7%。

3 讨 论

本文参考中国药典2005年版的银杏叶的质量标准[3]，并且针对本品的制备工艺及其他辅料各种因素及特性，对含量测定部分稍做改动，以保证检验方法的准确性。本缓释微丸胶囊中含有的辅料较为特殊，经实验证明，直接按药典方法的流动相系统会使色谱峰拖尾，适当调整流动相比例可获得较好峰型与分离度。本文建立的银杏叶缓释微丸胶囊的含量测定方法，经方法学验证结果满意。此方法简便准确、专属性强、精密度好、回收率高，为考察银杏叶缓释微丸胶囊的含量以及稳定性实验提供可靠的方法。

[1] 何正显,信玉琼.银杏叶的化学成分及抗自由基作用探讨[J].山西中医,2003,19(1):46-47.

[2] 洪梅,梁红,潘伟明.银杏叶黄酮类化合物生物效应研究概况[J].农业与技术,2003,2(1):33-35.

[3] 国家药典委员会.中国药典(Ⅰ部)[S].北京:化学工业出版社,2005: 220-221.

Determination of the Content of Haempferol, Isorhamnetin and Quercetin in Folium Ginkgo Pellets Capsules by HPLC

JIANG Dong-bo, MA Xiao-li, LI Chao-hui, CAI Wei-ming, GUAN Tang-ming
(Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang 524001, China)

ObjectiveTo establish a method for the determination of haempferol, isorhamnetin and quercetin in folium ginkgo pellets capsulesMethodsHPLC was performed on a C18column using mathanol-0.4%H3PO4(45∶55) as the mobile phase at a flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was at 360 nm. The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.ResultsThe linear range of quercetin was 0.1505-0.9030 μg (r=0.9999), the average recovery was 99.86% (RSD=0.4%); the linear range of haempferol was 0.1450-0.8940 μg (r=0.9998), the average recovery was 99.79% (RSD=0.5%); the linear range of isorhamnetin was 0.0995-0.5970 μg (r=0.9998), the average recovery was 99.80% (RSD=0.3%).ConclusionsThe method is simple, accurate, and special and can be used for the quality control of folium ginkgo pellets capsules.

Folium ginkgo pellets capsules; Haempferol; Isorhamnetin; Quercetin; HPLC

R9

B

1671-8194（2014）29-0012-02

*通讯作者：E-mail：J-D-BO@163.com