SCCmec相关的psm－mec在血液来源人葡萄球菌中的分布

杨永长，陈亮，肖代雯，喻华，刘华，黄文芳

（四川省医学科学院·四川省人民医院检验科，成都 610072）

psm－mec是2009年Queck等在SCCmec上发现的一种新基因，其位于移动遗传元件SCCmec（Staphylococcal Cassette Chromosome mec）上，主要存在于院内感染相关的SCCmec II和III型葡萄球菌中［1］。研究发现，psm－mec具有调控毒力和生物被膜的能力，psm－mec缺陷和psm－mec突变可增加耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的毒力，降低其生物被膜形成能力，在无生物被膜形成能力的表皮葡萄球菌中，导 入psm－mec 可 诱 导 生 物 被 膜 形 成［2－5］。Monecke等［6］发现psm－mec同样存在于人葡萄球菌中，人葡萄球菌可在婴幼儿和免疫抑制患者中引起菌血症［7－9］。到目前为止，尚未见血液来源人葡萄球菌psm－mec的相关报道。为了探讨psm－mec在人葡萄球菌中的功能，本研究首先采用分子生物学技术分析psm－mec在血液分离人葡萄球菌中的分布特征。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

25株人葡萄球菌来自2011年6月～2013年1月我院临床分离血培养阳性标本，所有菌株采用VITEK－2COMPACT全自动微生物分析系统鉴定。

1.2 仪器与试剂

全自动微生物鉴定系统（VITEK－2 COMPACT，法国生物梅里埃），PCR扩增仪（PTC－200，美国Bio－Rad），Gel Doc XR＋凝胶成像分析系统（美国Bio－Rad），SAV－570电泳仪（美国Savant）；PCR反应体系、100bp DNA marker购自北京康为世纪，mecA、psm－mec和SCCmec分型引物由上海invitrogen合成。

1.3 细菌收集和DNA提取

复苏低温保存的人葡萄球菌，接种至血平板，37℃5%CO2培养24h，收集细菌，10 000rpm离心5 min，沉淀加40μL DNA提取液，加热100℃10 min后，10 000rpm离心5min，上清液即为人葡萄球菌DNA。

1.4 PCR扩增人葡萄球菌mecA及psm－mec基因

根据文献［1］设计引物，PCR扩增人葡萄球菌的mecA 和psm－mec基因，mecA 引 物 序列为：mecA F 5＇－TCCAGATTACAACTTCACCAGG－3＇，mecA R 5＇－CCACTTCATATCTTGTAACG－3＇ ，PCR产物长度为527bp。反应体系：2×Taq Master Mix 5μL，上下游引物各0.25μL，DNA 1.5 μL，DH2O 3μL。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，最后72℃延伸5mim。psm－mec引物序列为：psm－mec F 5＇－CGAAAGCCTGAAT GCAAGTCT－3＇psm－mec R 5＇－GGATTTCACTGGTGTTAT TACAAGC－3＇PCR扩增产物长度为130bp。反应体系：2×Taq Master Mix 5μL，上下游引物各0.25 μL，DNA 1.5μL，DH2O 3μL。反应条件：95℃预变性3min，95℃变性30s，42℃退火30s，72℃延伸30s，进行30个循环，最后72℃延伸5mim。PCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后Bio－Rad凝胶成像仪检测。

1.5 多重PCR检测耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec型别

根据文献［10］设计引物，SCCmec扩增位点，引物序列和产物大小如表1所示。配制200nmol／L引物 KDP F1／R1、RIF4F3／R9为 M1；800nmol／L的引物DCS F2／R1、MECI P2／P3、IS431P4为 M2；400nmol的引物CIF2F2／R2、MECI P2／P3、RIF5 F10／R13、pUB110R1、pT181R为 M3。反应体系：2×Taq Master Mix 10μL，ddH2O 6μL，引物 M1 0.5μL、M2 0.5μL、M3 1μL，DNA 2μL。反应条件：94℃预变性4min，94℃30s，72℃30s，50℃30s，72 ℃ 1min，30个循环，72 ℃延伸4min。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后Bio－Rad凝胶成像仪检测。

表1 人葡萄球菌SCCmec扩增位点，引物序列和片段大小

2 结果

2.1 PCR扩增mecA和psm－mec基因的检测结果

PCR凝胶电泳结果如图1所示，25株血液分离的人葡萄球菌中，mecA阳性菌株占84%（21／25），mecA阴性菌株占16%（4／25）。在10株mecA阳性人葡萄球菌中检测到psm－mec基因，其余15株人葡萄球菌未检测到psm－mec基因。

2.2 多重PCR检测人葡萄球菌SCCmec分型

多重PCR凝胶电泳结果如图2所示，21株耐甲氧西林人葡萄球菌中，3株只扩增出A位点，暂定为SCCmec类I型，1株为SCCmecⅢA型，1株为SCCmecⅢB型，4株扩增出C和E或F位点，暂定为SCCmec类IIIA型，1株只扩增出A和C位点，暂定为SCCmec类IIIB型，3株只扩增出mecA，暂定为SCCmec类Ⅳ，剩下8株无法分型，暂定为SCCmec新型别（见表2）。

2.3 psm－mec在人葡萄球菌SCCmec的分布

分析mecA、psm－mec和SCCmec型别的关系，发现psm－mec基因主要分布在耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec III、类III型和SCCmec新型别上，其中1株分布于SCCmecⅢA，1株分布于SCCmecⅢB，4株分布于SCCmec类IIIA，1株分布于SCCmec类IIIB，3株分布于SCCmec新型别。而在11株耐甲氧西林人葡萄球菌和（3株SCCmecIV－dcs，3株SCCmec I－dcs，5株SCCmec新型别）4株甲氧西林敏感人葡萄球菌中不存在psm－mec基因（见表3）。

表2 多重PCR检测耐甲氧西林人葡萄球菌SCCmec型别

表3 psm－mec在人葡萄球菌SCCmec上的分布

图2 多重PCR扩增SCCmec的凝胶电泳结果

3 讨论

人葡萄球菌可感染婴幼儿和免疫力低下患者，Fajardo Olivares等［11］报道耐甲氧西林人葡萄球菌的分离率在凝固酶阴性葡萄球菌感染患儿中占第二位。Garza－González等［12］研究显示：临床分离的人葡萄球菌中，绝大部分都是甲氧西林耐药株。Mendoza－Olazarán等［13］发现血培养分离菌株中，81%为携带mecA的人葡萄球菌。本研究中，笔者发现血液来源的84%人葡萄球菌携带mecA，与文献报道基本一致。

甲氧西林耐药主要与mecA有关，其为编码低亲和力青霉素结合蛋白的外源性DNA以复合体的形式存在于可移动性SCCmec上。SCCmec由mec复合体和染色体盒重组复合体（ccr）两部分组成，根据mec和ccr同源性重组不同，可将SCCmec分为不同的类型。文献报道，绝大多数临床分离的耐甲氧西林人葡萄球菌属于不可分型SCCmec型别。2002年Oliveira等［10］以各型独特的基因结构为基础建立的多重PCR是目前应用最为广泛的SCCmec分型技术，本研究应用Oliveira多重PCR对21株mecA阳性人葡萄球菌分型，结果显示：1株属于SCCmec IIIA型，1株属于SCCmec IIIB型，19株无法分型。在无法分型的SCCmec多重PCR结果中，笔者发现3株只扩增出pls位点，暂定为SCCmec类I型（SCCmec I－dcs），4株扩增出C和E或F位点，暂定为SCCmec类IIIA型（3株SCCmecIIIA－Tn554／orfX，1株SCCmecIIIA－pI258／Tn544），1株扩增出A和C位点，暂定为SCCmec类IIIB型（SCCmecIIIB＋pls），3株只扩增出mecA，暂定为SCCmec类Ⅳ（SCCmecIV－dcs），剩下8株无法分型，暂定为SCCmec新型别。分型结果提示人葡萄球菌中SCCmec具有多样性，与国外报道［5］相似。

psm－mec基因是位于SCCmec上的一段DNA片段，一端与mecR1基因相连，另一端与xylR基因相连，主要存在于院内感染的SCCmec II型和III型中，研究显示，在金黄色葡萄球菌中，psm－mec具有调控MRSA毒力和生物被膜的能力，且psm－mec可存在于人葡萄球菌中［2－6］。为了探讨psm－mec在血液来源人葡萄球菌中的分布，在深入分析人葡萄球菌SCCmec型别的基础上，笔者通过PCR扩增psm－mec基因片段，分析其与SCCmec型别的关系。实验结果显示：血液分离的47.6%耐甲氧西林人葡萄球菌携带psm－mec基因，而在 MRSA中，大约10% 菌株携带psm－mec基因，MRSE中约68%携带此基因［6］，说明血液来源的耐甲氧西林人葡萄球菌psm－mec 的携带率与 MRSE相当，远高于MRSA的携带率。psm－mec阳性菌株中，70%菌株分布于SCCmecⅢ（IIIA和IIIB）和类III型（SCCmecIIIA－Tn554／orfX， SCCmecIIIA－pI258／Tn544，SCCmecIIIB＋pls），30%分布于SCCmec新型别。在psm－mec阳性的SCCmec新型别中，1株含 mec I、dcs和IS431／pUB110区域，1株含pls、kdp、mecI和pI258／Tn554区域，1株含pls、mecI和Tn554／orfX区域，接下来研究将进一步分析SCCmec新型别。

综上所述，本研究证实了psm－mec基因在血液来源的人葡萄球菌中分布广泛，主要存在于SCCmec III型、类III型和SCCmec新型别中，对了解人葡萄球菌的分子特征具有重要意义。

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