硅藻土提取LC-MS/MS法测定血液中马钱子碱和士的宁

2014-06-01吴玉红

警学研究 2014年6期

关键词：马钱子乙酸铵纳克

吴玉红，邵博，宋鹏

（1.重庆警察学院，重庆 401331；2.黑龙江省公安厅，黑龙江哈尔滨 150008；3.上海市公安局，上海 200025）

硅藻土提取LC-MS/MS法测定血液中马钱子碱和士的宁

吴玉红1，邵博2，宋鹏3

（1.重庆警察学院，重庆 401331；2.黑龙江省公安厅，黑龙江哈尔滨 150008；3.上海市公安局，上海 200025）

用硅藻土提取血液中马钱子碱和士的宁，用LC-MS/MS测定的方法。取检血1.0毫升加水溶液1.0毫升倒入硅藻土层析柱中，加二氯甲烷洗脱，洗脱溶剂中添加内标SKF525A，浓缩至干。剩余物用1.0毫升甲醇溶解，进行LC-MS/MS分析。士的宁和马钱子碱检出限分别为1.9纳克/毫升和2.3纳克/毫升；提取率均达到95%以上；线性范围0.01微克/毫升～10微克/毫升。该法可作为法医毒物常规检验方法。

马钱子碱；士的宁；血液；硅藻土；LC-MS/MS

马钱子碱和士的宁共存于马钱属的许多植物中，是一种常见的生物碱。士的宁是一种中枢神经兴奋剂，医疗上常用于治疗弱视症、瘫痪及再生障碍性贫血。马钱子碱常用于治疗中风引起的神经麻痹和用作健胃药，使用不当或服药过量，会引起中毒甚至死亡。

目前，生物检材中马钱子碱和士的宁的检验方法有紫外导数光谱法、［1］气相色谱法、气相色谱——质谱联用法［2］和高效液相色谱法，［3］以气相色谱——气质联用法最为常见。由于两种生物碱分子量相对较大，不易汽化，应用气相色谱和气相色谱——气质联用法需采用较高的柱温，灵敏度低，易造成柱流失，而采用高效液相色谱法易拖尾。为此，笔者建立了硅藻土提取方法和高效液相色谱——二级质谱联用检测技术，方法简单快速，提取率高，灵敏度高。

一、实验部分

（一）仪器、材料及试剂

LXQ液相色谱——质谱联用仪（美国Thermo Fisher公司）。

硅藻土：上海化学试剂厂进口分装，粒度为0.02毫米~0.045毫米。

人血：购自黑龙江省中心血站，加抗凝剂袋装保鲜人血，冷冻备用。

马钱子碱、士的宁：分析纯，质量符合国家药典规定；用甲醇配制成1.0毫克/毫升标准溶液。

甲醇为色谱纯；乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸铵溶液、醋酸、醋酸钠、碳酸、碳酸氢钠等均为分析纯。

（二）检测方法

1.仪器条件

液相条件：色谱柱HyPuRiTY C18 ODS（2.1毫米×150毫米 Column）（Thermo公司生产），流速0.20毫升/分钟，采集时间15分钟，进样量10.0微升，流动相：甲醇——5毫摩尔/升，乙酸铵溶液（pH=3.0～4.0）=70∶30。

质谱条件：采用电喷雾电离（IonSprary）-阳离子模式（ESI+）进行MRM方式检测，碰撞能量（CE）为35.0伏特，喷射电压5千伏，毛细管温度350摄氏度。

2.检测方法

取检血1.0毫升加水溶液1.0毫升倒入硅藻土层析柱中，加二氯甲烷洗脱，收集8.0毫升洗脱溶剂，添加5.0微升1.0毫克/毫升内标SKF525A，于50摄氏度水浴浓缩至干。剩余物用1.0毫升甲醇溶解。0.45微米滤膜过滤后，取10.0微升进行LC-MS/MS分析，内标标准曲线法进行定量分析。

二、结果与讨论

（一）工作曲线的制备

取1.0毫升空白血检材15份，分别加入0.01、0.1、1.0、5.0、10.0微克的士的宁、马钱子碱标准样品。按照上述方法进行提取，在洗脱液中分别添加SKF525标准品5.0微克，浓缩后取10.0微升进样。绘制工作曲线，线性回归方程及相关系数为：士的宁y=0.09x+0.01，r＝0.9897；马钱子碱y= 0.31x+0.04，r＝0.9890。

（二）硅藻土萃取条件的确定

取空白血液1.0毫升，添加100.0微克/毫升混合标准工作液1.0微升。分别在pH5.0、pH7.0、pH9.0条件，用乙醚、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯下进行分别提取，提取率见表1。

表1 血液中士的宁、马钱子碱在不同pH及洗脱溶剂条件下提取率考察（n=5）

实验发现，血中士的宁、马钱子碱的提取率受PH影响不大，用二氯甲烷作为洗脱溶剂，均能得到较好的提取效果。

（三）仪器条件的确定

1.质谱条件的优化

采用注射泵直接进样的方式，以20.0微升/分钟将10.0纳克/毫升的士的宁、马钱子碱标准溶液和SKF525A对照品溶液分别注入离子源中，采用仪器自动调谐的方式，获得最优的质谱检测条件，见表2。在正离子检测方式下对它们进行一级质谱分析，得到2种化合物的分子离子峰，然后分别对准分子离子峰进行二级质谱分析。选择士的宁、马钱子碱和SKF525A的检测离子对，见表3。

2.液相色谱条件的优化

由于士的宁、马钱子碱和SKF525A易溶于甲醇，选择甲醇作为流动相之一，同时选择水和5毫摩尔/升乙酸铵作为流动相之二。色谱结果表明，加入乙酸铵后峰形明显改善，提示应选择甲醇-5毫摩尔/升乙酸铵作为流动相溶剂。选择不同比例（90∶10，80∶20，70∶30，60∶40，50∶50，40∶60）的甲醇-5毫摩尔/升乙酸铵溶液作为流动相，分别观察它们的出峰情况。结果显示，甲醇含量减少，出峰时间过长；甲醇含量过大，峰拖尾严重；选择甲醇-5毫摩尔/升乙酸铵比例为70∶30时峰形和保留时间均较为合适。