大鼠左侧颈总动脉与颈外静脉吻合分流性肺动脉高压模型建立

赵科研，王辉山，尚长青，张继存，侯明晓＊

（沈阳军区总医院1.心血管外科；2.急诊医学部，辽宁沈阳110016）

大鼠左侧颈总动脉与颈外静脉吻合分流性肺动脉高压模型建立

赵科研1，王辉山1，尚长青2，张继存2，侯明晓1＊

（沈阳军区总医院1.心血管外科；2.急诊医学部，辽宁沈阳110016）

目的建立大鼠左颈总动脉与左侧颈外静脉吻合分流性肺动脉高压模型。方法成年雄性Wistar大鼠随机分为三组：吻合组（A组，n＝15），结扎组（B组，n＝15），正常组（C组，n＝15）。饲养3月后测定血流动力学指标，右心室／左心室＋室间隔质量比，肺组织切片病理变化，ELISA方法测定血浆ET－1浓度，荧光定量PCR测定肺组织表达内皮素－1mRNA的变化。结果与B，C两组相比，A组：右心室收缩压力明显升高，血清内皮素－1水平升高，荧光定量PCR结果显示A组内皮素－1mRNA的相对表达量是B组的2.601倍，是C组的3.373倍，B组是C组的1.297（P＜0.05）。结论通过分离左颈总动脉及左颈外静脉切断后，近心端吻合，可成功建立模拟先天性心脏病的分流性肺动脉高压模型，作为肺动脉高压标志的内皮素－1在此模型中处于高表达状态。

分流性；动物模型；肺动脉高压；内皮素－1

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1586）

肺动脉高压（pulmonary artery hypertension，PAH）在先天性心脏病中常见，主要为左向右分流导致肺血流明显增加，继发肺血管内膜纤维化，动脉中层肥厚，甚至肺小动脉阻塞等丛样损害为主，病变大部分相似［1］。建立良好的肺动脉高压模型是研究PAH的发病机制及临床治疗的基础。流量诱导的肺高压患者具有明显的围手术期死亡率和心脏手术较低的长期存活率［2］。本研究采用大鼠左侧颈总动脉和颈外静脉吻合方法建立分流模型，对于研究先天性流量增加的肺动脉高压具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象 成年雄性Wistar大鼠45只，体重150－200g，6周龄。购自沈阳军区总医院实验动物中心。

1.1.2 主要药品、试剂与仪器 荧光定量PCR试剂盒（大连宝生物），内皮素－1ELISA试剂盒（大连宝生物），DNA扩增仪（PT－200型，为美国PE公司），荧光定量PCR扩增仪（美国Applied Biosys－tems公司GeneAmp7300）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物的分组和模型建立 实验动物大鼠按体重随机分为三组：A.手术组（n＝15）；B.假手术组（n＝15）；C正常组（n＝15）。A组称重，腹腔注射戊巴比妥25mg·kg－1行全身麻醉［4］，四肢及头部固定于小手术台面。颈部纵行切口，约1.5cm，分离皮下组织及肌层，暴露左颈外静脉及左颈总动脉，充分游离，无创血管夹阻断近心端，远心端结扎、切断，生理盐水冲洗近心端至无血栓，11－0无创线间断端端吻合两血管，撤除血管夹，调整血管及松解周围组织。B组只分离左颈外静脉及左颈总动脉，分别做结扎术，不做吻合术；C组为正常大鼠，不做任何处理。3月后再次麻醉检查以下指标。

1.2.2 血流动力学指标 右心微导管测右心室收缩压（RVSP），压力波形经BL－420E系统记录并保存。

1.2.3 肺组织病理学观察 取大鼠的肺组织，置于10%中性福尔马林液中固定，经常规乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片，经HE染色，光学显微镜观察肺组织。

1.2.4 ELISA方法测定血浆内皮素－1（Endothelin－1，ET－1）浓度 步骤严格按照内皮素－1试剂盒说明书进行操作。根据标准品所测到的OD值作图，绘制标准曲线。统计各个样品的OD值，大鼠的内皮素－1含量与该曲线OD值相对应，分别查出并做好记录。

1.2.5 定量PCR测定肺组织表达内皮素－1mRNA的变化 ET－1和GADPH的基因序列通过基因库获得，引物设计结合参考文献和DNASIS软件（HITACHI SOFRWARE ENGINEERI NGCO. LTD）设计。ET－1上游引物5′－GCA TCC GCT GGT AGC AAG TGA－3′：ET－1下游引物5′–TCT ACA GAA ACT CCG CCC TGC－3′，GAPDH上游引物：5′－CGG AGT CAA CGG ATT TGG TGG TAT－3′；GAPDH下游引物：5′－AGC CTT CTC CAT GGT GGT GAA GAC－3′。提取总RNA，采用目的基因和内参基因进行荧光定量PCR反应，经逆转录反应，检测上述基因mRNA表达。溶解曲线都有各自的CT值，采用相对量法即△△CT法［5］计算。△CT（目的基因）＝CT（目的基因）－CT（内参基因），△△CT＝△CT（实验组）－△CT（对照组），目的基因相对表达水平＝2T－△△Ct，2T－△△Ct就是表示实验组目的的基因表达是对照组的变化倍数，使用这一方法可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量。

1.2.6 数据处理方法 数据采用x—±s表示，进行两样本均数的t检验（SPSS13.0，P＜0.05具有统计学意义）。

2 结果

2.1 一般情况

3月后各组大鼠未表现明显精神萎靡，进食减少，体重下降等，亦无肢体偏瘫及精神异常等表现。

2.2 血流动力学指标

右心室收缩压力［6］所测到的数值可见，A组的3月后右心室收缩压力35.67±3.48mmHg明显高于B组27.34±2.79mmHg和C组24.53±3.24 mmHg，B组略高于C组（P＜0.05）。

2.3 肺组织病理学观察

实验组肺小动脉管壁明显增厚，假手术组肺小动脉管壁薄，淋巴细胞较少，见图1。

图1 肺组织病理学观察

2.4 ELISA方法测定血浆ET－1浓度

经检测可以看出A组大鼠血清中的内皮素－1的含量（35.59±6.04）ρ／ng·L－1明显高于B组（29.41±3.48）ρ／ng·L－1，C组（26.45±2.53）ρ／ng·L－1，B组血清中的内皮素－1的含量略高于C组（P＜0.05）。

2.5 荧光定量PCR测定

结果显示，各组基因扩增的动力学曲线形状较为规整，基线水平较好，无上扬趋势，并且拐点清楚。各组的增长曲线［8］都符合标准的“S”型曲线。各组的△CT平均值后整理为下表1。

表1 三组的△CT平均值

最后根据公式目的基因的相对表达水平＝2T－△△Ct进而求出结果，如A组和C组相比较，结果＝2T－（9.50－11.65）＝3.373，意义为A组大鼠的肺组织内皮素－1mRNA的表达量是C组的3.373倍（P＜0.05）。依次计算可得，A组大鼠的肺组织内皮素－1mRNA的表达量是B组的2.601倍（P＜0.05），B组是C组的1.297倍（P＜0.05）。

3 讨论

分流法可以模拟先天性心脏病如动脉导管未闭、室间隔缺损、房间隔缺损等常伴有大量左向右血液分流［3］，超过肺血管代偿扩张限度，肺血管床容积相对不足，将直接导致肺动脉压力增高，可用于先天性心脏病肺动脉高压研究。

本实验通过动静脉吻合方法建立小动物分流模型通畅率高，与传统的穿刺法及导管结扎法相比方法确实，可重复性好；穿刺法一般多采用下腔静脉－腹主动脉，分流量不好控制。

ET［4，5］是目前体内最强大的具有收缩血管性能的特性物质，与多种疾病的病理生理变化密切相关，与具有舒张功能的一氧化氮［6］共同影响心功能。内皮素可以直接收缩肺血管，可以刺激肺动脉血管平滑肌DNA的合成和增殖［79］。Rubens C等［10］证实，循环中ET－1的水平是特发性肺动脉高压的标志，可以作为选择能够从ET受体拮抗剂治疗获得益处的患者的工具。本研究通过荧光定量测定肺组织表达ET－1mRNA的变化，采用血浆ET－1浓度来作为评测肺动脉高压的一个因素，为进一步实验提供了可靠依据。

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［9］Rubarryi M，Polokof A.Endothelins：Molecular，biology，biochemistry，pharmacology，physiology and pachophysiology［J］.Pharmacal Rev，1994，46：235.

［10］Rubens C，Ewert R，Halank M，et al.Big endothelin－1and endothelin－1plasma levels are correlated with the severity of primary pulmonary hypertension［J］.Chest，2001，120：1562.

Establishment model of new pattern and arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension in rats

ZHAO Ke－yan，

WANG Hui－shan，SHANG Chang－qing，et al.（Department of Cardiac Surgery，Shenyang Northern Hospital，Shenyang110016，China）

ObjectiveTo establish arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension by anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein.MethodsAdult male Wistar rats were randomly divided into three groups：anastomosis group（group A，n＝15），ligation group（group B，n＝15），normal group（group C，n＝15）.After feeding 3months，hemodynamic index，pathological changes of myocardial tissue and lung biopsy，the plasma ET－1concentration，and the change of lung tissue endothelin－1mRNA were determined.ResultsCompared with group B and C，the right ventricular systolic pressure increased significantly in group A.The concentration of plasma endothelin 1was higher significantly in group A than group B and C（P＜0.05）.Fluorescence quantitative PCR results showed that the relative expression level of endothelin 1mRNA in group A is 2.601times of that in group B，3.373times of that in group C，and that in group B is 1.297times of that in the group C（P＜0.05）.ConclusionThe arteriovenous shunt of pulmonary artery hypertension can be established successfully through anastomosis of the left common carotid artery and left external jugular vein.Endothelin－1is in a state of high expression in this model.

shunt；animal model；pulmonary artery hypertension；endothelin－1

R544.1＋6

A

2013－08－20）

1007－4287（2014）10－1586－03

中国博士后科学基金（2013M542471）；辽宁省科技攻关基金（2012225014）

＊通讯作者