青岛地区结核分枝杆菌rpoB变异与耐药相关性研究

苏海涛 王军 邹悦

青岛地区结核分枝杆菌rpoB变异与耐药相关性研究

苏海涛 王军 邹悦

目的 探讨青岛地区结核分枝杆菌的rpoB变异特征与利福平耐药的关系。方法 应用聚合酶链反应(PCR)直接测序法对来自青岛地区54株利福平耐药的结核分枝杆菌和14株利福平敏感的结核分枝杆菌的rpoB基因片段进行分析。结果 14株利福平敏感菌株中均未发生rpoB变异，而54株利福平耐药菌株中有46株发生了rpoB变异，变异率为85.19%（46/54）；rpoB变异在利福平敏感菌株和利福平耐药菌株中的分布差异有统计学意义（χ2=33.072，P=0）；16株利福平低浓度耐药菌株中有10株发生rpoB变异，而38株利福平高浓度耐药菌株中有36株发生rpoB变异，rpoB变异在利福平低浓度耐药菌株和利福平高浓度耐药菌株中的分布差异有统计学意义（χ2=6.893，P=0.009）；30株单耐利福平菌株中有24株发生rpoB变异，而24株多耐药菌株中有22株发生rpoB变异，rpoB变异在单耐利福平菌株和多耐药菌株中的分布差异有统计学意义（χ2=5.022，P=0.025）。结论 rpoB的变异是青岛地区结核分枝杆菌对利福平耐药的主要机制，且可能与耐药浓度及是否多耐药相关。

结核分枝杆菌；rpoB；利福平；耐药

利福平是抗结核化疗方案中一个关键药物，它在结核病化疗中起着重要作用。但是，在我国结核菌对利福平的耐药发生率呈上升局势[1]。随着分子生物学技术的发展，结核菌耐药的机制在基因水平已经逐渐阐明。研究发现结核分枝杆菌耐利福平与利福平作用的靶分子RNA聚合酶β亚单位的编码基因rpoB突变有关[2]。本研究应用PCR直接测序法检测结核分枝杆菌耐多药临床分离株的rpoB基因，对青岛地区利福平耐药结核分枝杆菌中rpoB的变异与利福平耐药之间的相关性进行了研究，为明确青岛地区利福平耐药的分子特征、帮助临床筛查耐利福平菌株及制定区域性耐药肺结核的标准化治疗方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源和药敏试验 68株结核分枝杆菌临床分离株均来源于青岛市胸科医院确诊的继发性肺结核患者，其中利福平敏感菌株14株，利福平耐药菌株54株，根据《结核病诊断细菌学检测标准化规程》进行分枝杆菌培养、抗酸染色、菌种鉴定，采用比例法按国际标准对分离的菌株进行利福平的药敏试验。利福平耐药菌株中，低浓度耐药菌株16例（药物浓度为50μg/ml），高浓度耐药菌株38例（药物浓度为250μg/ml），利福平单耐药菌株30例，多耐药菌株（包含耐多药）24例。

1.2 DNA制备与聚合酶链反应(PCR) 取100μl菌悬液加自制的裂解液[(50mmol/L NaOH、10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1% Triton X-100、1%NP-40、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)]200 μl，混匀，100℃煮沸 10 min,，12000r/min离心5min，离心半径7.9cm，取上清液作模板。置-20℃保存备用。

1.3 PCR反应

1.3.1 实验仪器 PCR反应扩增仪（加拿大 BBI公司）；3730测序列分析仪(美国 ABI公司)；SW-CJ-1D洁净工作台（江苏苏洁净化设备厂）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；DYY-8型稳压稳流电泳仪（上海琪特分析仪器有限公司）；YXJ-2离心机（湘仪离心机仪器有限公司）；H6-1微型电泳槽（上海精益有机玻璃制品仪器厂）；凝胶成像系统（Gene Genius公司）；移液器（范围 100～1000ml，20～200ml，0.5～10ml）（加拿大 BBI公司）。

1.3.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、10×PCR缓冲液(without Mg2+：100 mM Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mmol/L KCl，0.8%(v/v)Nonidet )；MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程上海有限公司）；PCR产物纯化回收试剂盒（生工生物工程上海有限公司SK1141）；10×TAE（400mmol/L三羟基氨甲烷醋酸盐Tris-acetate和10mmol/L乙二胺四乙酸二钠EDTA，pH8.0）。

1.3.3 引物设计 在GeneBank中查到rpoB基因（888164）的全序列，根据rpoB基因序列设计PCR引物序列1对，由上海生工生物技术公司有限公司合成，序列如下(5'to3')：上游引物F AGGACGTGGAGGCGATCA，下游引物R AACGGGTTGACCCGCGCGTA，应用上述引物对rpoB基因进行扩增的片段长度为358bp，包含81bp核心区。

1.3.4 PCR反应体系及反应条件 采用50μl 体系，包括模板 1 μl、上下游引物各 1 μl、10mmol/LdNTP 1 μl、Taq缓冲液 5 μl、25mmol/L MgCl2 5 μl、5U/μl TaqDNA聚合酶 0.5 μl、水 36.3 μl；反应条件：95℃预变性 3min，94℃变性 30s，55～60℃退火 35s，72℃延伸 40～50s，72℃修复延伸5～8min，35个循环。

1.4 测序 PCR产物纯化回收试剂盒（生工生物工程上海有限公司SK1141），测序。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件进行数据统计，计数资料组间比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增结果 68株临床分离株rpoB基因扩增后均得到长度为358 bp 的片段，扩增阳性率为100%（见图1）。

图1 PCR扩增rpoB基因片段

2.2 DNA测序结果 14株利福平敏感菌株中均未发生rpoB变异，而54株利福平耐药株中有46株发生rpoB变异，基因变异率为 85.19%（46/54）；46 株中 22 株（47.83%）为 81bp核心区531位密码子TCG-TTG变异，18株（39.13%）为81bp核心区526位密码子CAC-TAC变异，4株（8.70%）为81bp核心区

516位密码子GAC-GTC变异，2株（4.35%）为516位和526位密码子双点变异。16株利福平低浓度耐药菌株中有10株发生了rpoB变异，变异率为62.50%（10/16），其中6株为81bp核心区

531位密码子TCG-TTG变异，4株为81bp核心区526位密码子CAC-TAC变异；38株利福平高浓度耐药菌株中有36株发生了rpoB变异，变异率为94.74%（36/38），其中16株为81bp核心区531位密码子TCG-TTG变异，14株为81bp核心区526位密码子CAC-TAC变异，4例为81bp核心区516位密码子GAC-GTC变异，2例为516位和526位密码子双点变异。30株单耐利福平菌株中有24株发生rpoB变异，变异率为80.00%（24/30），而24株多耐药菌株中有22株发生rpoB变异，变异率为 91.67%（22/24）。

2.2.1 rpoB变异特征及其与利福平耐药表型的关系 14株利福平敏感菌株中均未发生rpoB变异，而54株利福平耐药株中有46株发生rpoB变异，rpoB变异在利福平敏感菌株和利福平耐药菌株中的分布差异有统计学意义（P＜0.01，见表1）。

2.2.2 利福平耐药程度与rpoB变异关系 16株利福平低浓度耐药菌株中有10株发生rpoB变异，而38株利福平高浓度耐药菌株中有36株发生rpoB变异，rpoB变异在利福平低耐药菌株和利福平高耐药菌株中的分布差异有统计学意义（P＜0.01，见表 2）。

表1 利福平耐药表型与rpoB变异关系（株）

表2 利福平耐药程度与rpoB变异关系（株）

2.2.3 利福平耐药菌株是否多耐药与rpoB变异关系 30株单耐利福平菌株中有24株发生rpoB变异，而24株多耐药菌株中有22株发生rpoB变异，rpoB变异在单耐利福平菌株和多耐药菌株中的分布差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 利福平耐药菌株是否多耐药与rpoB变异关系（株）

3 讨论

rpoB基因全长3543个碱基，rpoB基因编码合成核糖核酸的RNA的β亚单位。当81bp核心区发生突变，利福平不能与RNA聚合酶β亚基结合，导致细菌对利福平耐受，rpoB基因突变以531位、526位点突变最为常见[3]，且以上两个位点的突变是引起高水平耐药的主要原因。除上述两位点外，511、516、518、522位点也有突变，相对531和526较少，且是引起低水平耐药的原因。除突变引起耐药外，细胞壁渗透性的改变导致药物摄入量的减少也是导致耐药的原因之一[4]。本研究对来自青岛地区的54株对利福平耐药结核分枝杆菌临床分离株的分析表明，85.19%（46/54）的对利福平耐药菌株存在rpoB的变异，而14株对利福平敏感的结核分枝杆菌临床分离株中不存在rpoB的变异，本研究结果显示rpoB的变异形式为点突变，尤其是81bp核心区531位、526位变异是青岛地区结核分枝杆菌对利福平耐药的主要机制。朱敏等[5]报道在耐利福平菌株中，rpoB基因突变率达88.9%，以526、531位点改变最常见。孙勇[6]报道在利福平耐药菌株中，86.2%rpoB基因发生突变，突变主要集中在531、526、516 3个位点。周志红等[7]报道岳阳地区53株利福平耐药株中39株rpoB基因存在不同位点的变异，突变率为73.58%，突变位点包括531、526、522、516、513、511，最主要的突变位点集中在 531 和 526 位点。而国外报道[8]，对利福平耐药结核分枝杆菌的rpoB基因突变的发生率为92.7%～97.6%。产生上述差异的原因除了时间、地域及入选样本量不同外，还与不同抽样方法导致的结果差异性有关。

对利福平高浓度耐药菌株rpoB的变异率明显高于对利福平低浓度耐药菌株，提示rpoB的变异与高浓度耐药的相关性更高。多耐药菌株rpoB的变异率显著高于单耐利福平菌株，提示rpoB变异的结核分枝杆菌分离株可能更容易获得对其他抗结核药的额外耐药。还有对利福平耐药结核分枝杆菌未发现rpoB的变异，其耐药机制也可能是细胞膜通透性的改变，但也不能排除还存在利福平耐药的其他机制，有待进一步研究。本研究样本量较小，难以全面反映整个青岛市的利福平耐药结核分枝杆菌rpoB的变异特征，这些需要以后加大样本量，进行深入的研究，以期获得更加全面、精确的科学依据。

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Objective To investigate the relationship between rifampicin-resistance and mutation in rpoB of the tuberculosis mycobacterium from Qingdao area. Method The rpoB gene of 68 mycobacterium tuberculosis strains(54 rifampicin-resistant strains, 14 rifampicin-susceptible strains) were analyzed by the polymerase chain reaction direct sequencing technique. Results 46 of 54 rifampicin-resistant strains had mutation in rpoB,The mutation proportion is 85.19%; there was no gene change in rpoB of 14 rifampicin-susceptible strains. The mutation proportion in rpoB of rifampicin-resistant strains was signifi cantly higher than that of rifampicin-susceptible strains（χ2=33.072,P=0）; 10 of 16 low-level rifampicinresistant strains had mutation in rpoB, 36 of 38 high-level rifampicin-resistant strains had mutation in rpoB, The high-level rifampicin-resistant strains had a higher frequency of rpoB mutations than low-level rifampicin-resistant strains（χ2=6.893,P=0.009）; 24 of 30 single rifampicinresistant strains had mutation in rpoB, 22 of 24 multi-drug resistance tuberculosis strains had mutation in rpoB; The multi-drug resistance tuberculosis strains had a higher frequency of rpoB mutations than single rifampicin-resistant strains（χ2=5.022,P=0.025）. Conclusion The investigation indicated that rpoB mutation is the major molecular to generate the rifampicin-resistance in Qingdao area, may be associated with the concentration of bacterial drug resistance and multidrug resistance.

Tuberculosis mycobacterium; rpoB; Rifampicin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.10.004

山东省青岛市科技发展计划项目 (09-1-1-27-nsh)

山东 266043 青岛市胸科医院 (苏海涛 王军 邹悦)

苏海涛 E-mail：sht152@163.com