两种检测罗氏沼虾诺达病毒方法的比较

简贺君　谢俊刚

摘 要：分别用三抗体夹心酶联免疫吸附测定、逆转录聚合酶链式反应两种方法，检测20尾采集自广东省肇庆市的典型白肉病症状罗氏沼虾肌肉中的诺达病毒。检测结果是两种方法阳性检出率均为95%。结果表明，两种方法均能有效的应用在实验室检测罗氏沼虾诺达病毒。

关键词：罗氏沼虾；诺达病毒；三抗体夹心酶联免疫吸附测定；逆转录聚合酶链式反应

中图分类号 S966.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）08-151-03

Abstract：Three antibodies sandwich ELISA，reverse transcriptase polymerase chain reaction were used respectively to detect the Nodavirus from the muscle of 20 Macrobrachium Rosenbergii collected from Zhaoqing City，Guangdong Province，which have typical symptoms of white meat disease. The positive rate tested from these two methods was the same： 95%. The results of the comparison showed that both methods are effective on laboratory detection of Macrobrachium Rosenbergii Nodavirus.

Key words：Macrobrachium Rosenbergii；Nodavirus；Three antibody sandwich ELISA；Reverse transcriptase polymerase chain reaction

罗氏沼虾（Macrobrachium Rosenbergii）又名马来西亚大虾，属节肢动物门，甲壳纲，十足目，长臂虾科，虾科属，原产东南亚[1]。罗氏沼虾白浊病主要危害育苗期间的虾苗，虾苗淡化后放养到池塘3～5周内较易发生，其发病率一般为30%～70%，虾苗感染后死亡率高达90%，给我国罗虾养殖业造成巨大的经济损失[2]。

对于白浊病病原的研究，国外有学者从发病罗氏沼虾体内分离出病毒粒子[3]，钱冬等也发现罗氏沼虾白浊病病原是罗氏沼虾诺达病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV）[4，5]。MrNV病毒粒子呈廿面体，无囊膜，大小为23～25nm，病毒核酸为单链RNA，由2个片段组成，分别为3.0kb和1.3kb[6]。这种病毒传染性极强，虾苗感染病毒后可在7d左右出现症状，目前该病仍缺乏行之有效的控制方法。

患白浊病的虾苗呈现典型的肌肉白浊状，所以在生产中一般通过肉眼观察来判断虾苗是否携带病毒。但此法容易造成误判，一是因为带毒虾苗可能不表现出典型的肌肉白浊状，二是因为其它原因也可引起虾苗肌肉白浊，例如细菌感染、水质影响或化学药物作用。目前实验室有以下方法可检测此病毒：（1）电镜观察：取待检虾苗匀浆离心后，将上清液滴片做电镜观察，如发现23～25nm的病毒颗粒可确定为病毒感染。（2）病毒核酸鉴定：取待检虾苗，提取病毒核酸后电泳，看是否存在诺达病毒典型核酸。（3）酶联免疫吸附试验测定法（TAS-ELISA）[7]：利用抗原抗体的相互作用，检测虾苗是否携带病毒。（4）RT-PCR法：提取待检虾苗中的病毒核酸，采用聚合酶链式反应扩增病毒核酸进行检测，灵敏度较高。

本文采用了酶联免疫吸附试验测定法和RT-PCR法检测罗氏沼虾诺达病毒，通过检测结果对两种检测方法进行比较。

1 材料与方法

1.1 罗氏沼虾样品 罗氏沼虾虾苗于2008年4月～8月采集自广东省肇庆市，挑取典型白浊症状虾苗40尾，规格2～4cm，-20℃保存。

1.2 试剂 兔抗病毒血清、鼠抗诺达单克隆抗体、引物、标准阳性样品、标准阴性样品均由浙江省淡水水产研究所鱼病研究室钱冬教授惠赠。辣根过氧化酶标记羊抗鼠抗体、RT-PCR试剂盒、Trizol RNA抽提试剂购自宝生物工程（大连）有限公司。

包被液：碳酸缓冲液，0.01mol/L，pH9.6；封闭液：体积分数5%的小牛血清溶液（小牛血清50mL，1×PBS 950mL）；洗涤液：含0.05%Tween-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBST，pH7.4）；酶标二抗：羊抗兔IgG的羊IgG-HRP；底物液：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液，pH5.0，OPD 4mg/mL，H2O2 1.5μL/mL；终止液：2mol/L H2SO4。

1.3 TAS-ELISA操作步骤[8] （1）用包被液适当稀释兔抗血清，每孔100μL包被96孔ELISA板，烘箱内（37℃）放置1h后4℃下过夜备用。（2）包被好的ELISA板，用含0.05%Tween-20的pH7.4的磷酸盐缓冲液（PBST）洗涤3次，5min/次，甩干，将酶标板倒扣于滤纸上，吸去多余水分。（3）5%小牛血清/PBS溶液（小牛血清50mL，1×PBS 950mL），加入样品孔，37℃下封闭1h。（4）每孔加入100μL适当稀释的病毒样品、抗病毒单抗、辣根过氧化酶标记羊抗小鼠抗体等样品，加样后于37℃下孵育1h后用PBST洗涤3次，5min/次，甩干，将酶标板倒扣于滤纸上，吸去多余水分。（5）每孔加入OPD底物应用液，反应15min后，每孔加入50μL的终止液。使用酶标仪测定490nm处OD值。

1.4 RT-PCR操作步骤

1.4.1 RNA提取 取适量待检罗氏沼虾肌肉，加入适量的trizol试剂后匀浆，室温静置5min，加入1/5trizol体积量的氯仿，振荡混匀，室温静置5min，12 000g4℃离心15min，将上清液转移至新离心管，加入与上清液等体积的异丙醇，室温静置10min，12 000g4℃离心10min，向沉淀中加入1mL的75%乙醇清洗沉淀，12 000g4℃离心5min，弃上清保留沉淀，干燥。然后加入20μLDEPC处理过的水溶解沉淀，待用。endprint

1.4.2 RT-PCR反应体系 采用50μL反应体系。其中：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 10μL，dNTP Mixture（各10mM）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL，Control F-1 Primer（20μM）1μL，Control R-1 Primer（20μM）1μL，Positive Control RNA 1μL，RNase Free dH2O 24μL。

按以下条件进行RT-PCR反应：50℃15min；94℃2min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1.5min循环30次。

1.4.3 电泳 取10μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色20min，观察结果。

1.5 检测结果比对 分别利用TAS-ELISA法和RT-PCR法对罗氏沼虾样品进行检测，计算阳性检出率。

2 结果

分别利用TAS-ELISA法和RT-PCR法对2008年4月～8月采集的罗氏沼虾样品进行检测（结果见表1、表2）。由表1可见，发病症状均为白浊的罗氏沼虾样品检测结果并非全为病毒阳性，可能与其它原因引起的白浊有关。TAS-ELISA和RT-PCR两种方法均可有效的检测病毒阳性，且阳性检出率均为95%。

3 讨论

笔者实验室对2008年期间广东省肇庆市的罗氏沼虾虾苗白浊病进行了大规模的抽样检测，采集样品上百份，利用文中所述两种检测方法对所采集虾苗进行检测，对广东省肇庆市罗氏沼虾白浊病的流行情况有了一定的了解。由于罗氏沼虾白浊病危害较大，因此有效的利用检测方法，对该病进行提前防控是非常有必要的。

目前，TAS-ELISA和RT-PCR两种检测罗氏沼虾诺达病毒的方法都较为成熟，国内都有相关报道[7，9]。本文采用这两种较为成熟的方法进行检测应用的比对，检测结果表明，两种方法在实际应用中均能有效的检测罗氏沼虾诺达病毒，而且检出率较高，可靠性强。本次对比试验中出现了样品具有典型白浊症状但检测结果为阴性的情况，笔者认为这可能是其它原因引起虾苗肌肉白浊，并非诺达病毒感染引起。

TAS-ELISA利用包被的兔抗血清对病毒进行捕捉，同时通过单克隆抗体的级联放大以及对抗原高度特异性，大大提高了检测的灵敏度和特异性，检测灵敏度可达到1ng病毒蛋白。采用此方法检测，可先将兔抗血清预包被，待检测时可随时使用，检测过程大耗时约4h。由于结果测定可以通过酶标仪测定，也可肉眼观察判定，同时实验操作过程较为简便，省时省钱，适合批量检测，所以此法比较适合于基层单位开展病毒检测工作时使用。

RT-PCR法是通过提取待检样品中的病毒RNA，然后通过聚合酶链式反应扩增病毒的核酸，电泳后观察是否存在诺达病毒典型核酸。此法灵敏度极高，可检出7pg的病毒核酸。检测过程耗时约6h。但由于提取病毒核酸要求在无RNA酶的环境下进行，所有操作用试剂及吸头、离心管等都必须经RNA酶灭活后使用，而且对于检测者的实验技能也有较高要求。此法可作为罗氏沼虾白浊病确诊的检测方法，适合于实验条件较为完善的实验室开展病毒检测工作时使用。

参考文献

[1]张天澍，王玉凤.罗氏沼虾染色体研究[J].华中师范大学学报（自然科学版），2003，10 （2）：126-130.

[2]陆宏达，陈海清.罗氏沼虾肌肉白浊病的病原和组织病理[J].中国水产科学，2003，10 （2） ：126-130.

[3]Tung CW，Wang C S，Chen S N.Histological and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus （MMV） infectionin the giant freshwater prawn ，Macrobrachium rosenbergii （de Man） ，cultured in Taiwan[J].Journal of Fish Diseases，1999 ，12∶319-323

[4]钱冬，石正丽，曹铮，等.罗氏沼虾肌肉白浊病病原的鉴定[J].中国水产科学，2003，6.

[5]Qian D ，Shi Z L，Zhang S，et al .Extra small virus2like particles（XSV） and odavirus associated with whitish muscle disease in thegiant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii[J].J FishDis，2003，26：521-527.

[6]刘问，钱冬，吴健翔，等.罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用[J].水产学报，2005，29：529-533.

[7]钱冬，刘问，潘晓艺，等.罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2006，32（4）：377-382

[8]林清华.免疫学实验[M].武汉： 武汉大学出版社，1999：254-260.

[9]曾地刚，雷爱莹.逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）检测罗氏沼虾诺达病毒[J].广西农业科学，2006，37（6）：735-737.

（责编：张长青）endprint

1.4.2 RT-PCR反应体系 采用50μL反应体系。其中：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 10μL，dNTP Mixture（各10mM）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL，Control F-1 Primer（20μM）1μL，Control R-1 Primer（20μM）1μL，Positive Control RNA 1μL，RNase Free dH2O 24μL。

按以下条件进行RT-PCR反应：50℃15min；94℃2min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1.5min循环30次。

1.4.3 电泳 取10μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色20min，观察结果。

1.5 检测结果比对 分别利用TAS-ELISA法和RT-PCR法对罗氏沼虾样品进行检测，计算阳性检出率。

2 结果

分别利用TAS-ELISA法和RT-PCR法对2008年4月～8月采集的罗氏沼虾样品进行检测（结果见表1、表2）。由表1可见，发病症状均为白浊的罗氏沼虾样品检测结果并非全为病毒阳性，可能与其它原因引起的白浊有关。TAS-ELISA和RT-PCR两种方法均可有效的检测病毒阳性，且阳性检出率均为95%。

3 讨论

笔者实验室对2008年期间广东省肇庆市的罗氏沼虾虾苗白浊病进行了大规模的抽样检测，采集样品上百份，利用文中所述两种检测方法对所采集虾苗进行检测，对广东省肇庆市罗氏沼虾白浊病的流行情况有了一定的了解。由于罗氏沼虾白浊病危害较大，因此有效的利用检测方法，对该病进行提前防控是非常有必要的。

目前，TAS-ELISA和RT-PCR两种检测罗氏沼虾诺达病毒的方法都较为成熟，国内都有相关报道[7，9]。本文采用这两种较为成熟的方法进行检测应用的比对，检测结果表明，两种方法在实际应用中均能有效的检测罗氏沼虾诺达病毒，而且检出率较高，可靠性强。本次对比试验中出现了样品具有典型白浊症状但检测结果为阴性的情况，笔者认为这可能是其它原因引起虾苗肌肉白浊，并非诺达病毒感染引起。

TAS-ELISA利用包被的兔抗血清对病毒进行捕捉，同时通过单克隆抗体的级联放大以及对抗原高度特异性，大大提高了检测的灵敏度和特异性，检测灵敏度可达到1ng病毒蛋白。采用此方法检测，可先将兔抗血清预包被，待检测时可随时使用，检测过程大耗时约4h。由于结果测定可以通过酶标仪测定，也可肉眼观察判定，同时实验操作过程较为简便，省时省钱，适合批量检测，所以此法比较适合于基层单位开展病毒检测工作时使用。

RT-PCR法是通过提取待检样品中的病毒RNA，然后通过聚合酶链式反应扩增病毒的核酸，电泳后观察是否存在诺达病毒典型核酸。此法灵敏度极高，可检出7pg的病毒核酸。检测过程耗时约6h。但由于提取病毒核酸要求在无RNA酶的环境下进行，所有操作用试剂及吸头、离心管等都必须经RNA酶灭活后使用，而且对于检测者的实验技能也有较高要求。此法可作为罗氏沼虾白浊病确诊的检测方法，适合于实验条件较为完善的实验室开展病毒检测工作时使用。

参考文献

[1]张天澍，王玉凤.罗氏沼虾染色体研究[J].华中师范大学学报（自然科学版），2003，10 （2）：126-130.

[2]陆宏达，陈海清.罗氏沼虾肌肉白浊病的病原和组织病理[J].中国水产科学，2003，10 （2） ：126-130.

[3]Tung CW，Wang C S，Chen S N.Histological and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus （MMV） infectionin the giant freshwater prawn ，Macrobrachium rosenbergii （de Man） ，cultured in Taiwan[J].Journal of Fish Diseases，1999 ，12∶319-323

[4]钱冬，石正丽，曹铮，等.罗氏沼虾肌肉白浊病病原的鉴定[J].中国水产科学，2003，6.

[5]Qian D ，Shi Z L，Zhang S，et al .Extra small virus2like particles（XSV） and odavirus associated with whitish muscle disease in thegiant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii[J].J FishDis，2003，26：521-527.

[6]刘问，钱冬，吴健翔，等.罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用[J].水产学报，2005，29：529-533.

[7]钱冬，刘问，潘晓艺，等.罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2006，32（4）：377-382

[8]林清华.免疫学实验[M].武汉： 武汉大学出版社，1999：254-260.

[9]曾地刚，雷爱莹.逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）检测罗氏沼虾诺达病毒[J].广西农业科学，2006，37（6）：735-737.

（责编：张长青）endprint

1.4.2 RT-PCR反应体系 采用50μL反应体系。其中：10×One Step RNA PCR Buffer 5μL，MgCl2（25mM） 10μL，dNTP Mixture（各10mM）5μL，RNase Inhibitor（40U/μL）1μL，AMV RTase XL（5U/μL）1μL，AMV-Optimized Taq（5U/μL）1μL，Control F-1 Primer（20μM）1μL，Control R-1 Primer（20μM）1μL，Positive Control RNA 1μL，RNase Free dH2O 24μL。

按以下条件进行RT-PCR反应：50℃15min；94℃2min；然后94℃30s，60℃30s，72℃1.5min循环30次。

1.4.3 电泳 取10μLPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭（EB）染色20min，观察结果。

1.5 检测结果比对 分别利用TAS-ELISA法和RT-PCR法对罗氏沼虾样品进行检测，计算阳性检出率。

2 结果

分别利用TAS-ELISA法和RT-PCR法对2008年4月～8月采集的罗氏沼虾样品进行检测（结果见表1、表2）。由表1可见，发病症状均为白浊的罗氏沼虾样品检测结果并非全为病毒阳性，可能与其它原因引起的白浊有关。TAS-ELISA和RT-PCR两种方法均可有效的检测病毒阳性，且阳性检出率均为95%。

3 讨论

笔者实验室对2008年期间广东省肇庆市的罗氏沼虾虾苗白浊病进行了大规模的抽样检测，采集样品上百份，利用文中所述两种检测方法对所采集虾苗进行检测，对广东省肇庆市罗氏沼虾白浊病的流行情况有了一定的了解。由于罗氏沼虾白浊病危害较大，因此有效的利用检测方法，对该病进行提前防控是非常有必要的。

目前，TAS-ELISA和RT-PCR两种检测罗氏沼虾诺达病毒的方法都较为成熟，国内都有相关报道[7，9]。本文采用这两种较为成熟的方法进行检测应用的比对，检测结果表明，两种方法在实际应用中均能有效的检测罗氏沼虾诺达病毒，而且检出率较高，可靠性强。本次对比试验中出现了样品具有典型白浊症状但检测结果为阴性的情况，笔者认为这可能是其它原因引起虾苗肌肉白浊，并非诺达病毒感染引起。

TAS-ELISA利用包被的兔抗血清对病毒进行捕捉，同时通过单克隆抗体的级联放大以及对抗原高度特异性，大大提高了检测的灵敏度和特异性，检测灵敏度可达到1ng病毒蛋白。采用此方法检测，可先将兔抗血清预包被，待检测时可随时使用，检测过程大耗时约4h。由于结果测定可以通过酶标仪测定，也可肉眼观察判定，同时实验操作过程较为简便，省时省钱，适合批量检测，所以此法比较适合于基层单位开展病毒检测工作时使用。

RT-PCR法是通过提取待检样品中的病毒RNA，然后通过聚合酶链式反应扩增病毒的核酸，电泳后观察是否存在诺达病毒典型核酸。此法灵敏度极高，可检出7pg的病毒核酸。检测过程耗时约6h。但由于提取病毒核酸要求在无RNA酶的环境下进行，所有操作用试剂及吸头、离心管等都必须经RNA酶灭活后使用，而且对于检测者的实验技能也有较高要求。此法可作为罗氏沼虾白浊病确诊的检测方法，适合于实验条件较为完善的实验室开展病毒检测工作时使用。

参考文献

[1]张天澍，王玉凤.罗氏沼虾染色体研究[J].华中师范大学学报（自然科学版），2003，10 （2）：126-130.

[2]陆宏达，陈海清.罗氏沼虾肌肉白浊病的病原和组织病理[J].中国水产科学，2003，10 （2） ：126-130.

[3]Tung CW，Wang C S，Chen S N.Histological and electron microscopic study on Macrobrachium muscle virus （MMV） infectionin the giant freshwater prawn ，Macrobrachium rosenbergii （de Man） ，cultured in Taiwan[J].Journal of Fish Diseases，1999 ，12∶319-323

[4]钱冬，石正丽，曹铮，等.罗氏沼虾肌肉白浊病病原的鉴定[J].中国水产科学，2003，6.

[5]Qian D ，Shi Z L，Zhang S，et al .Extra small virus2like particles（XSV） and odavirus associated with whitish muscle disease in thegiant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii[J].J FishDis，2003，26：521-527.

[6]刘问，钱冬，吴健翔，等.罗氏沼虾诺达病毒单克隆抗体的制备及应用[J].水产学报，2005，29：529-533.

[7]钱冬，刘问，潘晓艺，等.罗氏沼虾诺达病毒TAS-ELISA检测法的建立及应用研究[J].浙江大学学报（农业与生命科学版），2006，32（4）：377-382

[8]林清华.免疫学实验[M].武汉： 武汉大学出版社，1999：254-260.

[9]曾地刚，雷爱莹.逆转录聚合酶链式反应（RT- PCR）检测罗氏沼虾诺达病毒[J].广西农业科学，2006，37（6）：735-737.

（责编：张长青）endprint