不同发酵条件对毛壳菌产木聚糖酶的影响

迟莉等

摘 要：通过对毛壳菌产木聚糖酶改变发酵条件，探讨毛壳菌木聚糖酶的生产能力及不同酶解条件对毛壳菌产生的木聚糖酶的影响，以确定其最佳培养基及发酵条件。结果表明，以玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%为发酵基质对产酶最为有利，当温度为39℃、pH4.6、发酵时间3d时产酶效果最好。

关键词：毛壳菌；木聚糖酶；发酵；优化

中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）08-46-03

Abstract：The experiment discusses the ability of Chaetomium xylanase production and the different affects of Enzymolysis conditions of xylanase Chaetomium，determine the most suitable medium and fermentation conditions through changing the Chaetomium fermentation condition of xylanase. The result showed that，with corn cob 4%+peptone 0.5%+yeast powder 0.5% as fermentation substrate of enzyme is most advantageous，when the temperature is 39℃，pH4.6，fermentation time 3D enzyme producing the best effect.

Key words：Chaetomium；Xylanase；Fermentation；Optimization

木聚糖是自然界中的一种丰富的再生资源，是最具代表性的半纤维素，是除纤维素外自然界中最丰富的多糖，其部分降解可形成低聚木糖[1-2]。低聚木糖是目前国际上极受关注的功能性低聚糖，是一种新型的食品添加剂，是目前食品工业研究开发的热点[3-6]。

木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶，在自然界分布相当广泛，由于其有着广泛的应用价值，越来越多的研究者对其进行了广泛而深入的研究。添加剂中使用的木聚糖酶多数是由微生物发酵生产的，分为固体发酵和液体发酵2种，而优化发酵条件对木聚糖酶的生产十分重要[7-8]。据了解，产木聚糖酶的微生物有几十个属、100多种，主要来源于细菌和真菌，其中微生物多为木霉、曲霉、青霉、链霉菌等真菌及芽孢杆菌[9-11]，研究者们仍在不断地寻找自然界中能高效表达木聚糖酶的菌种。

毛壳菌属为常见的霉腐菌，大多数具有较强的纤维素分解能力，鉴于毛壳菌属木聚糖酶的高产，本试验以角毛壳菌（Chaetomium cupreum sp.）作为研究对象，探讨温度、pH及培养基质、酶解条件对其发酵产酶的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 角毛壳菌（Chaetomium cupreum sp.），为黑龙江八一农垦大学生命学院实验室保藏。

1.1.2 仪器 恒温培养箱，752光栅分光光度计，恒温水浴锅（Hws24型），台式离心机，微量式移液器等。

1.1.3 培养基 （1）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯600g，去皮，洗净，平均切成3份小碎块，用纱布包好。将包好的马铃薯分别放入3个装有沸水的搪瓷杯中，煮沸20min。取出煮好的马铃薯，将剩余马铃薯汁液挤出，每杯加水定容至1 000mL。分别在每个杯中加入20g葡萄糖、2g MgSO4、1g KH2PO4和5g琼脂粉，搅匀、封口、灭菌待用。（2）产酶培养基：选择6种不同的发酵培养基，具体的配方：①麸皮4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。②玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。③麸皮+玉米芯4%（1∶1）+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。④麸皮+玉米芯4%（1∶3）+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%。⑤麸皮+玉米芯4%（1∶1）+（NH4）2SO4 2.0%+K2HPO40.1%+MgSO4 0.02%。⑥麸皮+玉米芯4%（1∶1）+KNO32.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化 将斜面试管中保存的毛壳菌种转入PDA平板中，倒置于28℃温箱中培养，菌落长好后待用。

1.2.2 液体发酵产酶试验 250mL三角瓶装100mL培养液，取角毛壳菌的孢子悬液接种，摇床转速140r·min-1，在27℃下培养。取发酵液用2层滤纸过滤，取上清液（粗酶液）留待测定木聚糖酶酶活。

（1）角毛壳菌孢子悬液制备：取已经培养好并产孢的毛壳菌，放于1.5mL Appendorf管中，加入无菌水并在震荡器上震荡，使子囊中的子囊孢子尽量释放出来，同时将Appendorf管中的菌悬液稀释至107个孢子·mL-1后待用。

（2）酶活测定方法：准确量取0.1mL酶液于试管中，加入1mL 2%的木聚糖醋酸缓冲溶液，50℃恒温15min，加入1mL 3，5-二硝基水杨酸（DNS）试液，沸水煮沸5min显色，冷却，定容至10mL，于540nm处读取吸光度值（以木糖计）。以蒸馏水加DNS液作空白[6]。

1.2.3 不同发酵基质对产酶的影响 以1.1.3中的培养基为发酵培养基，液体发酵产酶方法同1.2.2，培养后，每天定时测量酶活，并同时于不同的pH缓冲液（pH4.2、4.6、5.0、5.4）及温度（33、35℃）下测量，确定最适宜产酶的发酵培养基。

1.2.4 不同酶解条件对酶活性的影响 采用正交试验设计，测定pH、温度和发酵时间3个因素在2个水平上对木聚糖酶产生量的影响。endprint

2 结果与分析

2.1 不同发酵基质对产酶的影响

2.1.1 不同酶解温度对不同基质发酵液木聚糖酶的影响 实验结果表明：33℃的酶解温度下，不同基质下发酵获得的木聚糖酶酶活变化比较大，无论发酵3d还是4d，均以第5种基质的木聚糖酶活力最高，即以麸皮+玉米芯4%（1：1）+（NH4）2SO42.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%为基质产酶能力最强，而3，4或6基质都对产木聚糖酶不利，通过1，2培养基质的比较可以看出，玉米芯的加入有利于木聚糖酶的产生；但在35℃时，结果稍有改变，即发酵4d，基质2玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%对产酶最为有利（见图1、图2）。

分析不同酶解温度的试验结果发现，不同培养基质的综合表现中，均以2号培养基质的产酶能力较强，因此在利用毛壳菌生产木聚糖酶时，可以选用玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%为基本培养基。

2.1.2 不同酶解pH对不同基质发酵液木聚糖酶的影响 不同培养基质发酵液的产酶是否受到pH的影响，对不同的对发酵3d的培养基进行过滤，获得粗酶液后，测定木聚糖酶活力。结果表明，在不同酶解pH条件下，均以2号基质产酶能力最高，尽管在5号培养基上产酶能力也有较高值出现，但总体上还是以2号基质最为适宜（见表3）。故综合温度试验，应选用2号基质作为毛壳菌木聚糖酶粗酶液酶的生产。

但发酵4d的培养基质，过滤获得粗酶液后，同样在不同的pH酶解条件下，测定木聚糖酶的活性，结果表明，在4.2与4.6时（见图3），以2号培养基最为适宜产酶，而当pH提高到5.0和5.4时，却以5号培养基对产酶最为有利（见图4），这与以往的结果不同，不同酶解pH是否会影响发酵液酶的活性还有待于进一步研究。

2.2 不同酶解条件对酶活性的影响 从表2可以看出，当毛壳菌在温度为39℃，pH为4.6，培养时间3d时，产生木聚糖酶量最大。

3 结论

以毛壳菌为研究材料，改变发酵基质，发酵获得木聚糖酶，不同酶解温度及pH、不同基质中研究发现，几乎均为培养基质2产酶活性最高，即玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%对产酶最为有利；改变不同酶解条件，探讨温度、发酵时间、pH对发酵液酶活性的影响，结果表明，当温度为39℃、pH4.6、发酵时间3d时，产酶效果最好。

参考文献

[1]方微，单玉萍，李峰，等.木聚糖酶的作用机理及其在饲料中的应用[J].中国饲料，2011，（21）：21-24.

[2]郑建仙，耿立萍.功能性低聚糖析论[J].食品与发酵工业，1997，23（1）：39-47.

[3]苏小冰，翁明辉.超强益生元—低聚木糖[J].广州食品工业科技，2003，（19）：75-78.

[4]王璋，许时婴，汤坚.食品化学[M].北京：中国轻工业出版社，1999：56-57.

[5]王全军.低聚糖在动物饲养中的应用[J].中国饲料，2000，（16）：15-17.

[6]赵国志，王锡忠，温继发.低聚木糖的制取及应用[J].粮油食品科技，1998，（5）：18-20.

[7]刘唤明，梁运祥，吴健.木聚糖酶高产菌株的选育及其产酶条件的研究[J].中国酿造，2008（18）：17-19.

[8]李惠军，刘畅.木聚糖酶高产菌株的筛选及固态发酵条件的研究[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2007，27（3）：10-12.

[9]蔡爱华，何成新，曾健智.用于生产低聚木糖的木聚糖酶菌株筛选[J].广西科学，2004，11（4）：339-342.

[10]Bim Monica Andrea，Telma Teixeira Franco. Extraction in aqueous two-phase systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its application in kraft pulp bleaching [J].Journal of Chromatography B，2000，743：349-356.

[11]Teotia Sunita，R.Lata，M.N.Gupta.Free Polymeric Bioligands in Aqueous Two-Phase Affinity Extractions of Microbial Xylanases and Pullulanase[J].Protein Expression and Purification，2001，22：484-488.

（责编：张宏民）endprint

2 结果与分析

2.1 不同发酵基质对产酶的影响

2.1.1 不同酶解温度对不同基质发酵液木聚糖酶的影响 实验结果表明：33℃的酶解温度下，不同基质下发酵获得的木聚糖酶酶活变化比较大，无论发酵3d还是4d，均以第5种基质的木聚糖酶活力最高，即以麸皮+玉米芯4%（1：1）+（NH4）2SO42.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%为基质产酶能力最强，而3，4或6基质都对产木聚糖酶不利，通过1，2培养基质的比较可以看出，玉米芯的加入有利于木聚糖酶的产生；但在35℃时，结果稍有改变，即发酵4d，基质2玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%对产酶最为有利（见图1、图2）。

分析不同酶解温度的试验结果发现，不同培养基质的综合表现中，均以2号培养基质的产酶能力较强，因此在利用毛壳菌生产木聚糖酶时，可以选用玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%为基本培养基。

2.1.2 不同酶解pH对不同基质发酵液木聚糖酶的影响 不同培养基质发酵液的产酶是否受到pH的影响，对不同的对发酵3d的培养基进行过滤，获得粗酶液后，测定木聚糖酶活力。结果表明，在不同酶解pH条件下，均以2号基质产酶能力最高，尽管在5号培养基上产酶能力也有较高值出现，但总体上还是以2号基质最为适宜（见表3）。故综合温度试验，应选用2号基质作为毛壳菌木聚糖酶粗酶液酶的生产。

但发酵4d的培养基质，过滤获得粗酶液后，同样在不同的pH酶解条件下，测定木聚糖酶的活性，结果表明，在4.2与4.6时（见图3），以2号培养基最为适宜产酶，而当pH提高到5.0和5.4时，却以5号培养基对产酶最为有利（见图4），这与以往的结果不同，不同酶解pH是否会影响发酵液酶的活性还有待于进一步研究。

2.2 不同酶解条件对酶活性的影响 从表2可以看出，当毛壳菌在温度为39℃，pH为4.6，培养时间3d时，产生木聚糖酶量最大。

3 结论

以毛壳菌为研究材料，改变发酵基质，发酵获得木聚糖酶，不同酶解温度及pH、不同基质中研究发现，几乎均为培养基质2产酶活性最高，即玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%对产酶最为有利；改变不同酶解条件，探讨温度、发酵时间、pH对发酵液酶活性的影响，结果表明，当温度为39℃、pH4.6、发酵时间3d时，产酶效果最好。

参考文献

[1]方微，单玉萍，李峰，等.木聚糖酶的作用机理及其在饲料中的应用[J].中国饲料，2011，（21）：21-24.

[2]郑建仙，耿立萍.功能性低聚糖析论[J].食品与发酵工业，1997，23（1）：39-47.

[3]苏小冰，翁明辉.超强益生元—低聚木糖[J].广州食品工业科技，2003，（19）：75-78.

[4]王璋，许时婴，汤坚.食品化学[M].北京：中国轻工业出版社，1999：56-57.

[5]王全军.低聚糖在动物饲养中的应用[J].中国饲料，2000，（16）：15-17.

[6]赵国志，王锡忠，温继发.低聚木糖的制取及应用[J].粮油食品科技，1998，（5）：18-20.

[7]刘唤明，梁运祥，吴健.木聚糖酶高产菌株的选育及其产酶条件的研究[J].中国酿造，2008（18）：17-19.

[8]李惠军，刘畅.木聚糖酶高产菌株的筛选及固态发酵条件的研究[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2007，27（3）：10-12.

[9]蔡爱华，何成新，曾健智.用于生产低聚木糖的木聚糖酶菌株筛选[J].广西科学，2004，11（4）：339-342.

[10]Bim Monica Andrea，Telma Teixeira Franco. Extraction in aqueous two-phase systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its application in kraft pulp bleaching [J].Journal of Chromatography B，2000，743：349-356.

[11]Teotia Sunita，R.Lata，M.N.Gupta.Free Polymeric Bioligands in Aqueous Two-Phase Affinity Extractions of Microbial Xylanases and Pullulanase[J].Protein Expression and Purification，2001，22：484-488.

（责编：张宏民）endprint

2 结果与分析

2.1 不同发酵基质对产酶的影响

2.1.1 不同酶解温度对不同基质发酵液木聚糖酶的影响 实验结果表明：33℃的酶解温度下，不同基质下发酵获得的木聚糖酶酶活变化比较大，无论发酵3d还是4d，均以第5种基质的木聚糖酶活力最高，即以麸皮+玉米芯4%（1：1）+（NH4）2SO42.0%+K2HPO40.1%+MgSO40.02%为基质产酶能力最强，而3，4或6基质都对产木聚糖酶不利，通过1，2培养基质的比较可以看出，玉米芯的加入有利于木聚糖酶的产生；但在35℃时，结果稍有改变，即发酵4d，基质2玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%对产酶最为有利（见图1、图2）。

分析不同酶解温度的试验结果发现，不同培养基质的综合表现中，均以2号培养基质的产酶能力较强，因此在利用毛壳菌生产木聚糖酶时，可以选用玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%为基本培养基。

2.1.2 不同酶解pH对不同基质发酵液木聚糖酶的影响 不同培养基质发酵液的产酶是否受到pH的影响，对不同的对发酵3d的培养基进行过滤，获得粗酶液后，测定木聚糖酶活力。结果表明，在不同酶解pH条件下，均以2号基质产酶能力最高，尽管在5号培养基上产酶能力也有较高值出现，但总体上还是以2号基质最为适宜（见表3）。故综合温度试验，应选用2号基质作为毛壳菌木聚糖酶粗酶液酶的生产。

但发酵4d的培养基质，过滤获得粗酶液后，同样在不同的pH酶解条件下，测定木聚糖酶的活性，结果表明，在4.2与4.6时（见图3），以2号培养基最为适宜产酶，而当pH提高到5.0和5.4时，却以5号培养基对产酶最为有利（见图4），这与以往的结果不同，不同酶解pH是否会影响发酵液酶的活性还有待于进一步研究。

2.2 不同酶解条件对酶活性的影响 从表2可以看出，当毛壳菌在温度为39℃，pH为4.6，培养时间3d时，产生木聚糖酶量最大。

3 结论

以毛壳菌为研究材料，改变发酵基质，发酵获得木聚糖酶，不同酶解温度及pH、不同基质中研究发现，几乎均为培养基质2产酶活性最高，即玉米芯4%+蛋白胨0.5%+酵母粉0.5%对产酶最为有利；改变不同酶解条件，探讨温度、发酵时间、pH对发酵液酶活性的影响，结果表明，当温度为39℃、pH4.6、发酵时间3d时，产酶效果最好。

参考文献

[1]方微，单玉萍，李峰，等.木聚糖酶的作用机理及其在饲料中的应用[J].中国饲料，2011，（21）：21-24.

[2]郑建仙，耿立萍.功能性低聚糖析论[J].食品与发酵工业，1997，23（1）：39-47.

[3]苏小冰，翁明辉.超强益生元—低聚木糖[J].广州食品工业科技，2003，（19）：75-78.

[4]王璋，许时婴，汤坚.食品化学[M].北京：中国轻工业出版社，1999：56-57.

[5]王全军.低聚糖在动物饲养中的应用[J].中国饲料，2000，（16）：15-17.

[6]赵国志，王锡忠，温继发.低聚木糖的制取及应用[J].粮油食品科技，1998，（5）：18-20.

[7]刘唤明，梁运祥，吴健.木聚糖酶高产菌株的选育及其产酶条件的研究[J].中国酿造，2008（18）：17-19.

[8]李惠军，刘畅.木聚糖酶高产菌株的筛选及固态发酵条件的研究[J].郑州牧业工程高等专科学校学报，2007，27（3）：10-12.

[9]蔡爱华，何成新，曾健智.用于生产低聚木糖的木聚糖酶菌株筛选[J].广西科学，2004，11（4）：339-342.

[10]Bim Monica Andrea，Telma Teixeira Franco. Extraction in aqueous two-phase systems of alkaline xylanase produced by Bacillus pumilus and its application in kraft pulp bleaching [J].Journal of Chromatography B，2000，743：349-356.

[11]Teotia Sunita，R.Lata，M.N.Gupta.Free Polymeric Bioligands in Aqueous Two-Phase Affinity Extractions of Microbial Xylanases and Pullulanase[J].Protein Expression and Purification，2001，22：484-488.

（责编：张宏民）endprint