白灵菇木质素降解酶系的检测及其染料脱色能力的研究

于存等

摘要

[目的]明确白灵菇（Pleurotus ferulae）分泌木质素过氧化物酶（LiP）、锰过氧化物酶（MnP）和漆酶（Laccase）的規律，以及白灵菇染料脱色的能力。[方法]利用紫外可见分光光度计，检测4种培养方式下白灵菇木质素降解酶活性，并在此基础上进行了白灵菇对5种染料的脱色研究。[结果] 4种培养方式下，可以检测到MnP和Laccase的活性，但并未检测到LiP。添加Mn2+和2，6二甲氧基苯酚（2，6DMP）对MnP和Laccase的产生有抑制作用，而添加青杨木屑可以将MnP的活性提高1.28倍，将Laccase的活性提高3.75倍；白灵菇对中性红和活性黑2种染料的最大脱色率分别为87.12%和86.13%，对活性红和刚果红的最大脱色率分别为45.91%和32.28%，而对结晶紫几乎无脱色能力。[结论] 白灵菇产Laccace活性要高于MnP；与脱色活性红、刚果红、结晶紫相比，白灵菇对中性红和活性黑2种染料的脱色更为彻底。

关键词白灵菇；锰过氧化物酶；漆酶；木质素过氧化物酶；染料脱色

中图分类号S646文献标识码

A文章编号0517-6611（2014）06-01784-04

Abstract [Objective] The research aimed to understand the activities of Lignin Peroxidase， Manganese Peroxidase and Laccase of Pleurotus ferulae， and research the decolorization capacities on dyes by P. ferulae. [Method] By using UV/Vis spectrophotometer， the activities of ligninolytic enzymes of P. ferulae in four different culture conditions were detected. Furthermore， the decolorization capacities on five kinds of dyes by P. ferulae were studied. [Result] MnP and Laccase activity were detected without LiP in four different culture conditions. Adding Mn2+ and 2， 6DMP in the culture can inhibit the production of MnP and Laccase. By adding Populus ussuriensis wood chips， the capacity of MnP was improved by 1.28 times， and the capacity of Laccase was improved 3.75 times； that neutral red and reactive black were decolorized by P. ferulae effectively， the maximum decolorization ratio reached 87.12% and 86.13% respectively， and followed by reactive red and congo red， the maximum decolorization ratio was 45.91% and 32.28% respectively. In addition， there was hardly decolorization ability on crystal violet. [Conclusion] Producing of Laccase by P. ferulae is higher than MnP； decolorized of followed and reactive red more than thorough decolorized of neutral red and reactive black by P. ferulae.

Key words Pleurotus ferulae； Manganese Peroxidase； Laccase； Lignin Peroxidase； Dyes decolorization

白腐真菌 （whiterot fungi） 通过分泌木质素过氧化物酶（Lignin peroxidase，LiP）、锰过氧化物酶（Manganese peroxidase，MnP）和漆酶（Laccase）3种主要的木质素降解酶系，可以有效降解有机氯农药、多氯联苯、多环芳烃、卤素、合成染料等众多难降解的污染物[1-6]。

全世界每年大约生产8×105 t染料，其中至少有10%的染料进入到自然水体中[7]，这些染料不仅对自然界水体造成污染，还能直接或间接地对人体造成危害。目前，染料废水主要的处理方法有物理法、化学法和生物法，一般来说物理和化学方法对染料废水的处理率较高，但是存在操作不便且可能产生二次污染的缺点。而与物理和化学法相比，生物法具有处理量大且不产生二次污染的优点。白腐真菌作为微生物中的一大类群，由于可分泌漆酶 （Laccase）、过氧化物酶 （LiP） 和锰过氧化物酶（MnP）等多种胞外酶系及自身结构等特点，其在染料脱色方面的重要作用也逐渐被发现，近年来越来越多地受到人们的关注，成为生物法处理染料废水研究中的热点[8]。

白灵菇（Pleurotus ferulae Lanzi） 隶属于真菌界担子菌门伞菌纲伞菌目侧耳科，是一种含有丰富多糖、蛋白质、脂肪、氨基酸、维生素、食用纤维、多种矿物元素和微量元素的药食两用大型白腐真菌[9-10]。以往在其栽培、储运保鲜、分类、营养成分分析、多糖提取和食药用价值等方面已有大量报道[11-18]，但是对白灵菇木质素降解酶活性及其在染料脱色方面的研究，国内外还未见详细报道。笔者检测了不同底物作用下白灵菇分泌木质素降解酶的能力，并在此基础上进行了白灵菇对5种染料的脱色研究，从而为今后深入研究白灵菇木质素酶系统降解芳香族化合物的作用机制，及白灵菇在染料废水脱色方面的应用提供参考依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种来源。

白灵菇子实体采于黑龙江省伊春市东北林业大学凉水实验林场，菌丝体保存于东北林业大学森林保护学科森林病虫病理实验室4 ℃冰箱斜面培养基，试验前截取斜面培养基的小块菌丝接种于PDA平皿上，29 ℃活化10 d。

1.1.2培养基。PDA培养基：200 g马铃薯煮沸30 min后，添加20 g葡萄糖和15 g琼脂粉，加水定容至1 L。PDB培养基：200 g马铃薯煮沸30 min后，添加20 g葡萄糖，加水定容至1 L。

2结果与分析

2.1白灵菇4种培养方式下LiP活性的测定

4种不同培养方式下对白灵菇产LiP的酶活进行检测，结果在21 d内均未检测到吸光值的变化，表明白灵菇在4种培养条件下不产生LiP。

2.2白灵菇4种培养方式下MnP活性的测定

4种培养方式下21 d内白灵菇产MnP的结果见图1。由图1可知，4种培养方式下白灵菇均能产生MnP，且MnP活性呈先升高后

降低再升高的波动性变化。试验结果表明，培养方式A、B、D之间的产酶能力及酶活性随时间的变化趋势相似，都是在接入菌丝块的第3天时就能检测到MnP活性，且随时间的推移酶活性逐渐增加，直至第7天时酶活性达到最大，A、B、D对应的酶活性分别为13.28、10.47、9.07 U/L，之后酶活性均低于第7天，且呈现酶活性先降低再升高再降低的波动性变化。与A、B、D产酶不同，培养方式C在第9天时才出现一个酶活性高峰，酶活性为15.73 U/L，且酶活性在21 d内的酶活性曲线除第7天低于培养方式A外，其他时刻均高于其他3种培养方式下的MnP活性；2.3白灵菇4种培养方式下Laccase活性的测定

由于在小分子介体物质的存在下，Laccase可以氧化多种非酶底物的特性，其在食品和环保工业上的应用研究日益活跃[21]。4种培养方式下白灵菇产Laccase随时间变化结果见图2。由图2可知，4种培养方式下均能产生Laccase。培养方式A、B、D产酶能力接近，酶活性排序为A>D>B，表明添加Mn2+和2，6-DMP抑制了白灵菇产Laccase。培养方式C对应的Laccase活性明显高于A、B、D，表明添加青杨木屑可以显著提高白灵菇产Laccase的能力。另外，观察产Laccase随时间的变化趋势发现，培养方式A与C变化趋势相似，在3 d时开始产生酶活性，并随时间的推移逐渐增加，直至第9天后，酶活性出现波动性变化，至第17天酶活性有较大程度的提高且在19～21 d的酶活性维持在较高的水平，表明添加木屑并没有改变白灵菇产Laccase的趋势。A与C方式下最大酶活性分别出现在17 d和21 d，酶活性分别为39.67 U/L和 148.27 U/L，添加青杨木屑酶后Laccase活性提高了3.75倍；与A、C酶活变化趋势不同，B与D产Laccase的变化趋势相似，呈先升高分别在第5天和第7天达到酶活性最大值，酶活性分别为17.90 U/L和21.92 U/L，之后呈连续下降再升高的波动性变化。

是在3 d产生，然后迅速的升高，到7～9 d达到一个高峰值或者最大值，以后会迅速下降到一个较低值，然后缓慢地呈现升高之后下降再升高的波动趋势。Laccase的变化曲线同样在第3天产生，然后迅速升高，在7～9 d时达到一个峰值或最大值，之后呈现下降再升高的变化趋势，在17～21 d出现一个峰值或最大值。这与迷宫栓孔菌 （Trametes gibbosa）产酶不同[5]，酶活曲线变化相对更为复杂一些。试验结果表明，白灵菇产MnP和Laccase过程中Mn2+不是必需因子，在有无Mn2+的条件下均能產生酶活性，最大酶活量在加入Mn2+后有较小程度的下降。在培养过程中以木屑作为酶作用底物可以促进MnP和Laccase的分泌。而添加2，6DMP作为白灵菇产酶的底物对MnP和Laccase的产生有一定的抑制作用。图3为不同培养方式下MnP和Laccase在21 d内最大酶活性的比较，由图3可知，在各处理下Laccase酶活性都要高于MnP，分析这种差异，可能与氧化不同底物进行酶活性测定的方法有关，也可能在降解芳香族化合物的过程中Laccase要发挥更大的作用，从而分泌量更大。

2.5白灵菇对5种染料的脱色

多数真菌既有吸附染料又有降解染料的功能[24]。在白灵菇木质素降解酶系检测的基础上，为验证其染料脱色的能力，进行了白灵菇对3种不同结构类型的5种染料脱色的研究。该项试验首先以1 ml去离子水作为对照，在300～800 nm范围内对50 mg/L的5种染料进行染料最大吸收波长的测定，测定结果为：活性黑 （λmax=595 nm），活性红 （λmax=539 nm），刚果红 （λmax=501 nm），结晶紫 （λmax=584 nm）和中性红（λmax=528 nm）。白灵菇对5种染料11 d内的脱色效果见图4。由图4可知，除结晶紫几乎无脱色外，白灵菇对活性黑、活性红、刚果红、中性红均能产生一定的脱色。脱色1 d后对活性黑脱色最为彻底，脱色率为60.79%，活性红、刚果红和中性红依次减弱，脱色率分别为29.70%、20.09%、17.52%。1～5 d，除中性红染料的脱色率显著增加外，活性黑、活性红、刚果红染料的脱色率缓慢增加，且始终呈现脱色率活性黑>活性红>刚果红。5 d后几种染料脱色率达到较高水平，上下波动不大，且呈现脱色率中性红>活性黑>活性红>刚果红。活性黑、活性红、刚果红、中性红出现最大脱色率的时刻及脱色率分别为：活性黑 9 d，86.13%；活性红7 d，45.91%；刚果红5 d，32.28%；中性红 9 d，87.12%。综合以上结果，白灵菇对杂环类染料中性红、偶氮类染料活性黑有较强的脱色能力，对偶氮类活性红和刚果红脱色能力次之，而对三苯甲烷类染料结晶紫无脱色能力。

3结论与讨论

大多数白腐菌仅产生2种甚至1种分解木质素的酶，如鲜红密孔菌 （Pycnoporus cinnabarinus）只分泌Laccase，而不产生LiP和MnP，因此这3种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的[23-24]。该研究通过检测4种培养方式下白灵菇分泌LiP、MnP和Laccase的能力，发现白灵菇可以产生MnP和Laccase，但并不产生LiP。MnP和Laccase的活性受包含碳源种类、氮源种类、金属离子、诱导剂等多项培养条件及环境因子的影响[25-26]。Mn2+是白腐菌产MnP的必要因子，添加2，6-DMP作为产酶底物可以促进MnP和Laccase的分泌[20，24]。该研究在不添加Mn2+的培养方式下同样能检测到MnP的分泌，表明Mn2+不是白灵菇产MnP的必要因子。添加Mn2+和2，6-DMP对MnP和Laccase的产生有微弱抑制作用，而添加青杨木屑可以显著提高2种酶的活性。

白腐菌除了通过分泌胞外酶的降解作用进行染料脱色外，还通过菌体自身结构与染料相契合的吸附作用进行脱色，且由于不同种类染料的结构各不相同，因此脱色效果也会存在显著差异[1，27]。该研究中白灵菇可对中性红和活性黑2种染料有效脱色，脱色率高达87.12%和86.13%，对活性红和刚果红脱色次之，脱色率仅为45.91%和32.28%，而对结晶紫几乎不脱色。

参考文献

[1]

SI J，PENG F，CUI B K.Purification，biochemical characterization and dye decolorization capacity of an alkali-resistant and metal-tolerant laccase from Trametes pubescens[J].Bioresource Technology， 2013，128（1）：49-57.

[2] 潘忠成，赖娜，李琛，等.白腐菌在废水处理中的应用研究进展[J].化工技术与开发，2013，42（7）：59-63.

[3] CAMERON M D，TIMOFEEVSKI S，AUST S D. Enzymology of Phanerochaete chrysosporium with respect to the degradation of recalcitrant Compounds and xenobiotics [J].Appl Microbiol Biotechnol，2000，54（6）：751-758.

[4] 袁海生，戴玉成，曹云，等.白腐真菌染料脱色菌株筛选及一色齿毛菌脱色条件的研究[J].菌物学报，2010，29（1）：429-436.

[5] 司静，崔宝凯，戴玉成.东方栓孔菌在染料脱色中的应用及其脱色条件的优化[J].基因组学与应用生物学，2011，30（3）：364-371.

[6] 司静，崔宝凯，戴玉成.栓孔菌属漆酶高产菌株 的初步筛选及其产酶条件的优化[J].微生物学通报，2011，38（3）：405-416.

[7] PALMIERI G，CENNAMO G，SANNIA G.Remazol Brilliant Blue R decolourisation by the fungus Pleurotus ostreatus and its oxidative enzymatic sys tem[J].Enzyme Microb Technol，2005，36（1）：17-27.

[8] 周韶红.一株白腐真菌对刚果红染料的脱色研究[J].蚌埠学院学报，2012（5）：8-12.

[9] 马淑凤，陈利梅，徐化能，等.白灵菇菌丝体多糖的分离纯化及理化性质研究[J].食品工业科技，2009，12（30）：136-141.

[10] 林春，陈保生，李荣春.白灵菇研究进展[J].微生物学杂志，2004，24（3）：46-49.

[11] 林杰.白灵菇栽培技术要点[J].中国食用菌，2000，19（5）：28-29.

[12] 冯丽琴，江常杰.白灵菇储运保鲜技术[J].农村百事通，2007，13（1）：13-14.

[13] KIM B H，CHOI D，PIAO Y L，et al.Comparative study on the antioxidant and nitrite scavenging activity of fruiting body and mycelium extract

from Pleurotus ferulae[J].Korean Journal of Chemical Engineering，2012，29（10）：1393-1402.

[14] 胡顺珍，徐梅，贾乐.白灵菇胞外多糖液体培养条件优化[J].食品工业科技，2007，28（7）：76-81.

[15] 王波，唐利民，熊鹰，等.白灵侧耳（白灵菇）种质资源评价[J].菌物系统，2003，22（3）：502-503.

[16] 常金芳，郁建锋，冀宏.白灵菇rDNA-ITS序列多态性分析[J].常熟理工学院学报：自然科学版，2012，26（8）：61-65.

[17] 戴玉成，杨祝良.中国药用真菌名录及部分名称的修订[J].菌物学报，2008，27（6）：801-824.

[18] 戴玉成，周丽伟，杨祝良，等.中国食用菌名录[J].菌物学报，2010，29（1）：1-21.

[19] KIRK T K，SCHULTZ E，CONNORS W J，et al.Influence of culture parameters on lignin met abolism by phanerochaete chrysosorium[J].Archives of microbiology，1978，117（3）：277-285.

[20] 池玉杰，闫洪波.红平菇木质素过氧化物酶系统漆酶、锰过氧化物酶及木质素过氧化物酶的检测[J].林业科学，2009，45（12）：154-158.

[21] 励建荣，李丹.漆酶在食品工业中的应用[J].现代食品科技，2006，22（4）：262-264.

[22] SI J，CUI B K，DAI Y C.Decolorization of Chemically different dyes by whiterot fungi in submerged cultures[J].Annals of Microbiology，2013，63：1099- 1108.

[23] 王蓓，王圓，周晓云，等.锰过氧化物酶（MnP）的研究进展[J].化工技术与开发，2005，34（4）：28-34.

[24] 尹立伟.猴头菇CB1锰过氧化物酶全长cDNA基因克隆及序列分析[D].哈尔滨：东北林业大学，2010：2-5.

[25] 景致远，李吕木.锰过氧化物酶研究进展[J].饲料博览，2009（1）：11：8-11.

[26] 刘文华，蔡宇杰，范晶晶，等.毛栓军产漆酶条件优化及该酶对合成染料脱色的研究[J].微生物学通报，2013，40（5）：727-738.

[27] 赵丽艳，赵敏，卢磊，等.一色齿毛菌漆酶介体系统在染料脱色中的应用[J].北京林业大学学报，2011，33（4）：130-135.