红色LED光源对肝损伤大鼠肝再生影响的研究

孙建钢，刘式浩，董宏伟，侯陈宁，谢盈慧，刘子豪，王欣悦，纪刊，崔妍，李莉

（1. 河北大学临床医学院，河北 保定 071000; 2. 河北大学基础医学院，河北 保定 071000）

随着人类对红光的不断研究，红光对机体的许多作用不断地被发现。如红光可减轻损伤组织中的炎症反应[1]；增强线粒体中多种酶的活性，加速细胞的新陈代谢，提高机体免疫力[2]；促进肉芽组织生长，加速创伤愈合[3]。红光还可提高血液中血红蛋白含量，增加红细胞数目，提高血液携氧能力[4]。因此，红光被越来越多地应用于祛斑美容、消炎、保健等方面的临床治疗。发光二极管（light emitting diode，LED）光源作为一种新型的高效节能光源已经广泛地应用于摄影、通讯、农业等多个领域，也正逐步在生物医学领域中展现出广阔的应用前景。肝脏作为人体的一个具有生物合成、解毒、分泌胆汁、免疫等重要功能的器官，却对缺血、缺氧的耐受性较差，以致损伤后其功能恢复较为困难，至今未能发现有效的治疗肝脏损伤的方法。肝脏一旦损伤将会对人体产生较大的影响。本研究通过应用红色LED光源对肝损伤大鼠进行照射治疗，观察红光对肝损伤大鼠肝脏再生功能的影响，为将来肝脏损伤后的治疗探索一种新思路、新方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康雌性SD大鼠50只，体质量230～280 g，由河北医科大学医学实验动物中心提供。

1.2 实验材料

氨基甲酸乙酯（上海山浦化工有限公司）；盐酸利多卡因注射液（1005283，山东华路制药有限公司）；硫酸庆大霉素（068110305，石药集团欧意药业有限公司）；10%甲醛溶液（天津市凯通化学试剂有限公司）。红色LED光源(河北大学物理学院)；采血管（10050，江苏健康医疗用品有限公司）。

1.3 动物分组

健康雌性SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只。分别为空白对照组、肝损伤模型组、10 min照射组、20 min照射组、30 min照射组。各组大鼠常规饲养，自由饮食饮水。

1.4 建立大鼠肝脏损伤模型

1.4.1 术前准备

大鼠术前12 h禁食，自由饮水。在术前1 h给大鼠灌食牛奶（1 mL/100 g），以利于大鼠顺利度过麻醉期，提高大鼠术后存活率。

1.4.2 麻醉方法

以25%氨基甲酸乙脂2.4 mL/kg（0.6 g/kg）对大鼠实施腹腔注射麻醉，该剂量可使大鼠处于四肢无力的状态，如果大鼠反应激烈可追加0.05 mL（追加总量不超过0.1 mL）。

1.4.3 手术区备皮

将剑突上1 cm至剑突下3 cm ，腹部正中线右侧2～3 cm 至腹部正中线左侧1 cm区域，剪毛后用脱毛剂脱毛。应用2 %碘伏消毒2次。

1.4.4 局部麻醉

左手轻提右侧肋弓下缘的皮肤，在自腹中线左侧1 cm 至腹中线右侧2 cm皮下注射利多卡因注射液1 mL，进行局部麻醉。

1.4.5 模型制备

沿右侧肋弓下缘自腹中线左侧0.5 cm 至腹中线右侧1.5 cm做一长约2 cm 的腹部斜切口，依次切开皮肤、腹部肌肉和腹膜进入腹腔。充分暴露肝脏，离断镰状韧带，将要结扎的肝中叶、肝左中叶（即结扎叶，其余肝叶统称再生叶）牵托出切口，用准备好的光面乳胶材料于肝中叶与左中叶分叶的上部进行结扎，结扎力度以结扎的肝叶刚出现变色为宜，将肝叶还纳腹腔复位，腹腔喷洒硫酸庆大霉素0.03 mL（约0.6万U/kg）。检查结扎处无出血后即可逐层缝合腹壁关闭腹腔。

1.4.6 术后护理

术后密切观察大鼠反应、活动状态、饮食饮水及切口愈合情况，术后每日肌肉注射庆大霉素1.2万U/kg，每日1次，连续3 d。待大鼠基本恢复正常活动后，自由饮食饮水。

1.5 照光

将各组SD大鼠置于体积为20 cm×20 cm×20 cm的纸盒中，盒盖按照光源形状于正中开口，将红色LED光源置于开口处进行照射。红光物理参数：波长660 nm，半值角20°，功率1 W，光通量70 lm。

空白对照组，不做任何处理。模型组大鼠进行模型复制后不予LED红光照射。10 min照射组、20 min照射组、30 min照射组大鼠在进行模型复制后给予LED红光照射每天2次，连续照射4周。各照射组每次照射的时间分别为10 min、20 min、30 min。

1.6 检测指标

各组实验大鼠均于造模4周后进行腹主动脉采血，进行血清酶学检测即谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT），处死后取肝脏，对各叶称重并计算再生叶占肝总质量比例（再生叶质量/肝总质量），并取再生叶（空白对照组取同名肝叶）制作切片进行组织形态学观察。

1.7 统计学处理

所有实验数据资料均经Excel建立数据库，利用SPSS16.0进行数据分析。多组均数间的比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD法。以P＜0.05为差异有统计学意义，实验数据均以s表示。

2 结果

2.1 血清酶学检测结果

各治疗组ALT均低于模型组， 30 min照射组AST低于模型组（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠肝功能比较（ s ，n=10）

表1 各组大鼠肝功能比较（ s ，n=10）

与空白对照组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 AST ALT空白对照组 138.00±26.67 24.70±6.51模型组 159.36±23.38 36.90±7.33＃10 min 照射组 146.74±37.97 24.44±2.01*20 min 照射组 146.55±28.53 19.43±5.46*30 min 照射组 110.44±32.87* 19.80±2.98*

2.2 各组再生叶占肝总质量比例结果

各治疗组大鼠再生叶占肝总质量比例均较模型组增大（P均＜0.05），10 min照射组及20 min照射组再生叶比例均大于空白对照组（P均＜0.05），见表2。

表2 各组肝脏再生叶占肝总质量比例（ s，n=10）

表2 各组肝脏再生叶占肝总质量比例（ s，n=10）

与空白对照组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

组别 再生叶占肝总质量比例空白对照组 65.34±9.89模型组 61.35±17.22 10 min 照射组 77.09±6.50＃*20 min 照射组 77.43±9.15＃*30 min 照射组 73.32±5.53*

2.3 组织形态学观察结果

光镜下观察，空白对照组肝细胞无变性坏死，肝小叶结构清晰，肝细胞索围绕中央静脉呈放射状排列，肝血窦清晰，见图1A。模型组可见少量炎细胞浸润，肝细胞轻度再生，部分肝细胞水肿，见图1B。10 min照射组、20 min照射组、30 min照射组肝细胞再生明显，肝细胞核明显增大，可见双核及核分裂象，未见明显纤维组织再生，见图1C、1D、1E。

图1 各组肝组织形态学（HE ×800）

3 讨 论

肝脏是成年人体内的一个重要器官，其受损后对机体影响较大，故其损伤后良好的再生情况就显得尤为重要。ALT和AST是评价肝功能的灵敏指标，该两项指标的升高程度与肝细胞的受损程度呈正相关[5]，其中ALT主要分布于肝细胞胞质，肝细胞轻度受损时即可释放入血。而AST主要分布于肝细胞线粒体内，肝细胞受到较严重损伤时才能释放入血，故ALT较AST更为敏感。本研究结果显示，各照射组ALT均小于模型组，并且已恢复正常，30 min照射组AST小于模型组，这表明红光照射治疗有助于肝损伤大鼠肝功能的恢复。

本研究发现，10 min照射组及20 min照射组再生叶比例均大于正常，各治疗组再生叶比例均大于模型组，肝脏再生叶组织学观察也显示治疗组以及模型组再生叶均有不同程度再生，其中各治疗组肝细胞再生情况较模型组明显，肝细胞核明显增大，可见双核及核分裂象，表明各治疗组肝叶再生能力较模型组明显增强，甚至超过了正常大鼠。这一结果提示红色LED光源照射对肝细胞的再生可能有促进作用。

LED光源因具有耗能小、热辐射低、无污染、安全、覆盖光波范围广等优点已应用于许多实验研究中[6-7]。本研究采用的红色LED光源能产生600～700 nm波段的高能红光，对人体穿透性较强，穿透深度可达2.5 cm 以上[8]，因此红光可以直接作用于神经、血管等组织发挥多种生物学效应。

红光对于肝损伤大鼠肝脏再生的促进机理尚不清楚。推测其可能与红光所具有的促进血管内皮细胞生长因子（VEGF）合成分泌[3]；促进人体碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）分泌[3]；促进人体VEGF的表达[9]；增加机体的血液携氧能力及血氧饱和度[4]；使急性炎症反应的持续时间明显缩短，促进IGF-1的表达, 提高组织再生速度、愈合质量[1]等作用有关。红光影响肝脏再生及肝功能恢复的确切机制还有待进一步深入的研究。

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