潍坊地区136例自然流产胚胎组织的染色体分析

陶华娟 蔡坤 修霞 路兴军 王磊

（山东省潍坊市妇幼保健院 遗传科，山东 潍坊 261011）

随着医疗水平和人民生活水平的提高，孕产妇及新生儿死亡率都有了明显的降低。然而，自然流产率在临床确诊妊娠中为10%～15%[1]，仍然居高不下。导致自然流产的病因复杂，包括遗传因素和环境因素，其中遗传因素主要包括流产夫妇和流产胚胎的染色体异常。本研究通过对染色体正常夫妇的流产胚胎进行染色体分析，以探讨自然流产的发生与胚胎染色体异常的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集2012年8月至2013年9月在潍坊市妇幼保健院妇科或计生科行流产术的患者136例，年龄21～40岁，平均29.5岁，妊娠周数5～26周，平均孕8＋6周；同时要求满足以下条件：①排除双亲染色体异常；②B超提示胚胎停止发育；③排除母体疾病所导致的流产。136例流产组织中（双胎3例），包括132例绒毛组织，4例死胎肌肉组织。所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 流产组织的采集 无菌条件下，用生理盐水清洗流产绒毛组织，去除母血及母体蜕膜组织，选取生长状态良好的绒毛组织用于细胞培养和FISH检测。

1.2.2 流产组织染色体标本制备 用手术刀片将绒毛组织切碎，消化后在37℃，5%CO2浓度下静置培养。收获、制片、G显带各步骤均按照标准操作流程进行；每例标本常规计数分析20个中期分裂象，并用染色体核型分析软件分析5个核型。培养超过1个月细胞仍不生长时，视为培养失败[2]。

1.2.3 流产组织的FISH检测 取剪碎的流产组织经洗涤、制备玻片、预处理及变性杂交、杂交后洗涤等步骤处理后在荧光显微镜下观察结果，并用荧光图像处理系统（美国PSI公司）进行荧光图像采集和分析。

1.3 统计学方法 用SPSS15.0统计软件进行统计处理，χ2检验P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 136例自然流产组织标本中，染色体正常70例，异常66例，异常率为48.53%。FISH检测结果见图1。

图1 荧光显微镜下FISH的检测结果（核为DAPI染色×1 000倍）

图A为47，XX，＋13所用13/21探针组，绿色信号代表13号染色体，红色信号代表21号染色体；图B为47，XY，＋16所用16/22探针组，红色信号代表16号染色体，绿色信号代表22号染色体；图C为47，XY，＋22所用16/22探针组，红色信号代表16号染色体，绿色信号代表22号染色体；图D为45，X所用18/X/Y探针组，天蓝色信号代表18号染色体，绿色信号代表X染色体。

2.2 136例自然流产组织98例细胞培养成功，38例培养失败，培养失败率为27.94%，136例经FISH全部检测成功，比较98例FISH与核型分析结果，一致率为97.96%，见表1。

2.3 136例自然流产组织根据孕妇的年龄分组，染色体异常率不同，但两两间比较差异无统计学意义，见表2。

2.4 136例自然流产组织根据孕妇的自然流产情况分组，其中流产1次者80例，复发性流产者56例，其染色体异常率分别为48.75%和48.21%，比较差异无统计学意义，见表3。

3 讨 论

随着医学科技的不断发展，如产前筛查和产前诊断技术的应用，避免了染色体异常患儿的出生，使我国妇女儿童健康有了很大的提高，但对于自然流产患者，目前尚无明确的检查指标和有效的治疗措施。染色体异常是自然流产最常见的原因，包括胚胎染色体异常和流产夫妇的染色体异常，其中前者是导致自然流产发生的主要原因。在本研究中，FISH联合G显带检测出流产组织染色体异常率为48.53%，可见染色体异常是导致流产的重要因素之一。早期报道显示50%～70%自然流产与染色体异常有关，胚胎染色体数目异常的主要原因在于配子发生的减数分裂中或受精卵的早期卵裂过程出现了染色体复制和行为异常。

表1 66例染色体异常病例的异常类型及异常率

表2 孕妇不同年龄组染色体异常率

表3 不同流产次数染色体异常率

自然流产组织存在的主要染色体异常类型是三体型、三倍体和单体型，有细胞遗传学研究表明，导致自然流产发生的主要是染色体的数目异常（86%），其次有染色体的结构异常（6%）和嵌合体（8%），在我们的98例细胞遗传学检测病例中，染色体数目异常44例（91.67%），染色体结构异常2例（4.17%），嵌合体2例（4.17%），与以往研究基本一致，主要表现为染色体的数目异常。流产胚胎的染色体异常大都是新发的染色体异常，表明其异常的发生主要是由于配子形成和胚胎发育早期随机发生[3]。以往报道表明三体的发生与母体高龄有很大关系，40岁以上的孕妇因其产生的卵子质量下降因此流产率更高，但是否会导致胚胎染色体异常尚未见报道[4]，随着目前社会结婚年龄和育龄的推迟，胚胎三体型的发生率可能有所增加。在本研究中，不同年龄组孕妇的流产胚胎染色体异常率不同，但两两间比较差异无统计学意义，这可能与部分年龄组的病例数过少有关，对于流产胚胎的染色体异常率与孕妇年龄的相关性，我们将进行进一步的研究。

复发性流产是指连续或不连续流产发生2次及2次以上者[5]。不同流产史孕妇其流产胚胎组织的染色体异常发生率不同，有文献报道第一次流产染色体异常率更高，随着流产次数的增加，染色体异常的频率呈下降趋势[10，11]，如 Merel[6]等通过对1359例自然流产标本进行细胞遗传学分析，发现复发性流产胚胎组织染色体异常率为39%，低于初次流产胚胎组织的染色体异常率45%。但我们的研究比较初次流产与复发性流产其胚胎的染色体异常率差异无统计学意义。复发性流产主要与父母双方染色体异常有关，主要包括随机联合和染色体异态，本研究排除双亲染色体异常，因此对复发性流产组织染色体异常率的检测结果可能与其他研究有所不同。既往研究表明[7]，5%的夫妇受到复发性流产的影响，复发性流产孕妇染色体平衡易位发生率为2%～5%，高于普通人群，但对于其染色体的总体异常发生率目前尚无一致结论。

一般认为早期流产胚胎50%存在染色体异常，也有报道认为染色体异常实际发生率可能明显高于这个比例，只是常规染色体核型分析的检出率低[8]。在该研究中，对于自然流产组织的检测，我们不仅选用了核型分析的方法，而且采用了FISH检测技术，FISH检测不仅具有检测快速的特点，而且可以不通过细胞培养直接检测间期核。自然流产组织经阴道排出，存在污染的可能性，导致细胞培养的失败率增加，以往报道，在检测流产组织时存在5%～42%的培养失败率[9，10]。FISH因其检测快速的优点，目前已被广泛用于产前诊断，快速出具检测结果有利于减轻孕妇及家属的精神负担，并为临床医生进行早期处理提供宝贵时间，减轻晚期引产对孕妇身体的伤害。

因此，目前发展的分子遗传学可弥补传统细胞培养后核型分析的一些缺点，分子遗传学诊断技术主要包括全基因组诊断（chromosomal-CGH和array-CGH）染色体特定部位基因诊断技术（FISH，MLPA和QF-PCR），主要用于细胞培养失败染色体的检测。Shearer[11]等收集流产组织5555例，其中培养失败762例，对这762例标本进行FISH检测，727例检测成功，成功率为95%，检出异常181例，异常率为25%。同时，也有研究应用FISH技术的Y染色体特异性探针，用于母体细胞污染的鉴定。然而，这些分子遗传学检测方法因种种原因还不能完全取代核型分析技术，如成本高、实验操作复杂、无法检测染色体结构异常、检测的基因变异临床价值不确定等缺点，因此目前仍无法取代核型分析。

有研究表明，自然流产组织除了核型分析可发现的染色体异常外，通过aCGH发现有5%存在核型分析不能发现的基因拷贝数的变异，但对于这些拷贝数变异的临床价值还不能确定，截至目前仅有一项研究[12]，同时检测了双亲与流产胚胎的基因拷贝数变异，通过比较基因拷贝数变异是新发还是遗传于双亲而判断基因拷贝数变异的临床价值。

总之，随着分子生物学的不断发展，多种技术已被广泛用于染色体疾病的产前诊断，使产前诊断的水平不断提高，诊断结果快速准确。产前诊断有利于胎儿的早期诊断，以决定胎儿取舍，避免患儿出生，达到优生的目的；同时对于曾孕有染色体异常患儿的夫妇，再次生育受累患儿的风险率增加，因此此类家庭在计划妊娠或再次怀孕时，有必要接受遗传咨询和产前诊断。

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